[摘要] 目的 探讨Dickkopf-1在喉咽癌组织中的表达及其与各临床病理因素的关系。 方法 选择2008年1月～2013年12月来源于承德医学院附属医院的30例喉咽癌组织和10例喉咽部正常黏膜组织，采用免疫组化SP法检测中组织的Dickkopf-1的表达情况。 结果 ①Dickkopf-1在喉咽癌组织中的阳性表达率（36.67%），明显低于喉咽部正常黏膜组织（80.00%），差异有统计学意义（P < 0.05）。②Dickkopf-1在喉咽癌组织中的表达与淋巴结转移、临床分期、病理分级、临床分型、年龄和肿瘤大小无关（P > 0.05）。 结论 Dickkopf-1在喉咽癌组织中低表达可能与喉咽癌发生有关。
[关键词] 喉咽癌；Dickkopf-1；免疫组化
[中图分类号] R739.65 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（a）-0019-04
喉咽癌亦称下咽癌，在国外其发病率约占每年新发头颈部恶性肿瘤的5%，占全身恶性肿瘤的0.3%；在国内其发病率约占每年新发头颈部恶性肿瘤的1.4%，占全身恶性肿瘤的0.2%[1]。绝大多数为鳞状细胞癌，男性多发，最常见部位是梨状窝，女性的喉咽癌多发生在环后区。虽然喉咽癌发病率较其他头颈部恶性肿瘤相对较低，但是由于其发生位置隐蔽，相对临床症状出现较晚，患者就诊时多已经处于晚期。喉咽部有丰富的区域淋巴管，因此发现时往往伴有广泛的区域淋巴结转移。喉咽癌生物学性质恶劣，组织分化差，预后不良，喉咽癌已成为头颈部恶性肿瘤中治疗效果最差的肿瘤之一。尽管过去的几十年里，喉咽癌的治疗模式发生了重大变化，包括外科手术、放疗和化疗等多学科综合治疗变得极为重要。但总的5年生存率仍为25%～40%，基础和临床研究均在努力寻求新的治疗方案来最大限度的提高生存率和降低喉咽癌的发病率。在目前已知的多种高发性恶性肿瘤中Wnt信号传导途径的失调与肿瘤的发生、发展密切相关，其通过调控下游靶基因的表达，进而来影响细胞凋亡、迁移和侵袭。作为Wnt通路的抑制因子，Dickkopf-1（DKK-1）蛋白是近年来发现的Dickkopfs（DKKs）家族成员之一。大量研究发现，Dickkopf-1蛋白通过经典Wnt/β-连环蛋白信号传导途径以及非经典Wnt信号传导途径在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，是当今肿瘤分子生物学的研究热点。本研究应用免疫组织化学技术检测喉咽癌和喉咽部正常黏膜组织中Dickkopf-1的表达情况，并分析Dickkopf-1表达与各临床病理因素之间关系，试图为探讨喉咽癌的发生、发展提供一定的理论基础和实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
选择2008年1月～2013年12月承德医学院附属医院（以下简称“我院”）耳鼻咽喉科住院手术治疗的30例喉咽癌患者手术切除的癌组织，经术后病理证实所切除喉咽部肿瘤组织均为鳞状细胞癌；患者均为男性，年龄为39～71岁，中位年龄56岁；术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗；有淋巴结转移（根据术后病理决定有无淋巴结转移）24例，无淋巴结转移6例；临床分期采用1997年UICC TNM分类分期标准，Ⅰ～Ⅱ期4例，Ⅲ～Ⅳ期26例；高分化4例，中分化17例，低分化9例；临床分型：梨状窝癌18例，喉咽后壁癌12例；肿瘤直径<3 cm 10例，≥3 cm 20例。另外选择我院耳鼻咽喉科同期手术切除非喉咽癌患者的喉咽部正常黏膜组织10例作为对照，均经术后病理证实；其中男9例，女1例；年龄31～65岁，中位年龄51岁。本研究经医院伦理委员会批准通过，全部患者及家属均知情并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 标本采集及处理 所取新鲜组织均在离体后立即放入10%中性甲醛中固定，经常规石蜡包埋后制成5 μm厚组织切片备用。
1.2.2 主要试剂 由美国Santa Cruz公司提供的Dickkopf-1兔抗人多克隆抗体（sc-25516）；由北京四正柏生物科技有限公司提供的即用型DAB显色试剂盒；SP试剂盒是由福州迈新生物技术有限公司提供的即用型快捷免疫组化Max Vision试剂盒。
1.2.3 实验方法 采用免疫组织化学（SP）法，按照实验说明书严格进行各实验步骤：石蜡标本常规5 μm连续切片，电热恒温箱80℃烤箱50 min，切片浸入二甲苯常规脱蜡，梯度酒精水化，3%H2O2室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS浸泡5 min。微波炉加热0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至沸腾后将上述组织切片放入，抗原热修复15 min，室温冷却40 min，PBS冲洗，滴加一抗，4℃冰箱过夜。PBS冲洗，滴加二抗，湿室内孵育15 min。PBS冲洗，DAB显色5 min，蒸馏水冲洗，终止显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂胶封片，镜检。一抗稀释比例为1∶100，以PBS代替一抗做阴性对照，以美国Santa Cruz公司提供的阳性对照片做阳性对照。
1.2.4 判定结果 采用Volm双评分法分别由3名经验丰富的病理科医生在光镜200倍下随机选择5个染色均匀视野进行观察，根据其评分的平均值判定结果：①按染色强度进行评分：无显色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；②按阳性细胞百分率进行评分：阳性细胞百分率≤25%为1分，阳性细胞百分率26%～50%为2分，阳性细胞百分率>50%为3分。最后将以上两项得分结果相加：0～2分判定为“+”，3～4分判定为“++”，5～6分判定为“+++”。“+”为阴性表达，“++”和“+++”为阳性表达。
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 喉咽癌组织及喉咽部正常黏膜组织中的Dickkopf-1蛋白的表达情况
Dickkopf-1蛋白阳性表达呈棕黄色着色，阳性染色定位于细胞浆。Dickkopf-1在喉咽癌组织及正常喉咽部黏膜组织中均有表达，在喉咽癌组织中的阳性表达率明显低于喉咽部正常黏膜组织，差异有统计学意义（χ2 = 4.0434，P = 0.0443）。见图1～2（封三）、表1。
2.2 喉咽癌临床病理因素与Dickkopf-1蛋白表达的关系
Dickkopf-1蛋白在喉癌组织中的表达与淋巴结转移、临床分期、病理分级、临床分型、肿瘤大小、吸烟量和年龄无关（P > 0.05）。见表2。
3 讨论
Dickkopf-1为一种分泌型糖蛋白，Glinka等[2]于1998年在两栖动物非洲蟾蜍胚胎细胞内首次发现Dickkopf-1蛋白，是一种有力的Wnt信号通路拮抗剂，在胚胎头颈形成期起重要作用。有学者在2000年发现，人Dickkopf-1基因位于10 号染色体10q11上。进一步研究表明，β-catenin可调控其下游靶基因Dickkopf-1的作用，可能与Wnt信号通路的负反馈调节有关[3-4]。学者首次在人HEK239T 细胞中提取出Dickkopf-1，其分子量约为45 kU，随着研究的不断深入，更多学者研究发现从不同细胞中提取出的Dickkopf-1的分子量存在一定差异，35～45 kU不等[5-6]。Dickkopf-1蛋白拥有255～350个氨基酸残基，通过cDNA编码，靠近N端的Cys-1和靠近C端的Cys-2为两个富含半胱氨酸的保守区域。靠近C端的Cys-2是由10个半胱氨酸残基构成，在全部Dickkopfs家族成员Dickkopf-1～4中均呈高度保守状态，在抑制经典Wnt信号传导通路过程中发挥决定性作用[7-8]。目前已知的Dickkopf-1受体有两种：一种是低密度脂蛋白受体（LRP-5/6）；另一种是kremen蛋白受体。Dickkopf-1通过竞争结合LRP5/6蛋白受体直接抑制Wnt蛋白的活性，或通过Kremen蛋白受体间接与LRP5/6蛋白受体结合，导致细胞膜表面LRP5/6蛋白受体水平明显下降，从而抑制Wnt蛋白向细胞内传导信号，阻断Wnt信号传导途径[9]。Dickkopf-1蛋白在不同肿瘤细胞中的表达情况及意义各有不同，但在喉咽癌中是否表达及其意义，尚未见相关报道。
本研究发现在喉咽癌组织中Dickkopf-1的阳性表达率明显低于喉咽部正常黏膜组织中的阳性表达率Dickkopf-1，差异有统计学意义，提示Dickkopf-1蛋白表达可能与喉咽癌的发生有关。这与很多学者的实验研究结果是一致的，在多种恶性肿瘤组织中Dickkopf-1表达下调。崔素芬等[10]对36例宫颈癌组织标本进行Dickkopf-1阳性表达检测，结果显示Dickkopf-1阳性表达呈现明显下调。伊诺等[11]检测并比较Dickkopf-1在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达情况，结果显示子宫内膜癌组织中Dickkopf-1表达明显低于正常子宫内膜组织。Mikheev等[12]研究发现，外源性注入Dickkopf-1后宫颈癌Hela 细胞池中的Hela 细胞生长速度明显减慢，而大剂量外源性注入Dickkopf-1有助于诱导宫颈癌细胞的凋亡。有异常甲基化出现于Hela细胞内的Dickkopf-1基因启动子区，可能与组蛋白降解有关[13]。Licchesi等[14]研究表明，在进展中的肺腺癌中，Dickkopf-1启动子区域的甲基化导致Dickkopf-1的低表达。仵正等[15]研究发现，Dickkopf-1在胰腺癌细胞中低表达，MSP分析发现约40%的Dickkopf-1在胰腺癌细胞中表达为甲基化。然而应用去甲基化调节剂处理后Dickkopf-1基因的表达明显上调。Yamaguchi等[16]及陈恒君等[17]分别通过实验研究发现，Dickkopf-1抑制恶性黑色素瘤的生长及其功能是通过抑制β-catenin来发挥作用，对恶性黑色素瘤细胞的增殖及功能调控有着至关重要的作用。乔玲等[18]经研究发现间充质干细胞BMMS-03通过释放Dickkopf-1，进而抑制Wnt/β-catenin信号途径，对乳腺癌MCF-7细胞的恶性表型具有明显抑制作用。
Kenji等[19]研究发现，Dickkopf-1在无淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的表达明显高于有淋巴结转移者，提示Dickkopf-1参与肿瘤细胞的转移和侵袭。侯安丽等[20]研究结果显示宫颈鳞状细胞癌分化程度越差，Dickkopf-1的表达也越低，有淋巴结转移者表达明显低于无淋巴结转移者，临床分期越晚，Dickkopf-1的表达也明显降低。Naoki等[21]研究结果表明，Dickkopf-1在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）组织中表达下调，作为抑癌基因在肿瘤的发生、侵袭和转移过程中充当重要角色，与肿瘤预后相关。而本研究结果显示，在喉咽癌组织中Dickkopf-1的表达与淋巴结转移、临床分期、病理分型、临床分型、肿瘤大小、吸烟量和年龄无关。考虑与本实验样本量较小有关，增大样本量后进一步实验研究，预期发现其在喉咽癌肿瘤细胞侵袭及转移中的作用。
Dickkopf-1作为Wnt信号传导途径抑制分子，与喉咽癌发生有关，预期成为喉咽癌治疗及预防的新靶点，具体作用机制，有待进一步研究。
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（收稿日期：2014-08-16 本文编辑：苏 畅）