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摘要：为了探索猪IgG1-Fc（pIgG1-Fc）基因在大肠杆菌中的高效表达，首先通过反转录PCR（RT-PCR）扩增 pIgG1-Fc 基因，并构建重组表达质粒pET30a（+）-pIgG1-Fc，转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达，然后通过优化异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导浓度、菌体培养温度及菌体培养时间，实现pIgG1-Fc重组蛋白的高效表达。结果表明，成功克隆了pIgG1-Fc的基因666 bp，共编码222个氨基酸;重组原核表达质粒pET30a（+）-pIgG1-Fc经过酶切和测序证明构建正确，重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中能够表达，表达的融合蛋白分子量约为36 ku。其最佳表达条件如下：在25 ℃条件下加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导6 h可形成大量包涵体蛋白。pIgG1-Fc基因被成功克隆并原核表达，为进一步研究该蛋白的功能及实现其他蛋白与pIgG1-Fc融合后原核表达奠定了基础，为制备能与猪IgG1结合的二抗提供了材料。
关键词：Fc;原核表达;包涵体;融合蛋白
中图分类号： S858.28;Q785;Q786
文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2019）15-0091-03
自20世纪末多克隆抗体出现以来，相继出现了杂交瘤单克隆抗体和基因工程抗体。当前，抗体相关技术在疾病诊断、药物靶向性治疗、免疫预防、抗体融合蛋白制药等领域被广泛应用[1-3]。其中，与宿主主要免疫球蛋白恒定区中Fc片段（CH2和CH3功能区）共同表达的融合蛋白被很多科研人员关注，如疫苗开发、新药物研制等[4-5]。前期更多的研究者都是对Fc及其融合蛋白进行真核表达，以期实现Fc的功能活性，但是真核表达量均较低，成本比较高，限制了Fc融合蛋白的工业化生产。相关文献也表明，一些人源Fc融合蛋白已实现原核表达，且表达产物具有生物活性[6-7]。因此，本研究拟克隆猪IgG1的Fc基因（pIgG1-Fc），并进行原核表达，然后对其诱导表达的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度、表达温度和表达时间进行了优化，对融合蛋白表达的可溶性进行了分析，为进一步研究pIgG1-Fc融合蛋白的原核表达和工业化生产提供基础。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌株
pET30a（+）、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3），由安阳工学院河南省动物疫病防控与营养免疫院士工作站保存。
1.2 试剂
限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、DNA分子质量标准DL 2000、反转录试剂盒、PCR扩增酶，均购自大连宝生物工程公司;酵母抽提物、胰蛋白胨、异丙基硫代半乳糖苷，购自Solarbio生物公司;胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒，均购自Omega Bio-tek。PCR引物合成和DNA测序，均由金维智生物科技有限公司完成。
1.3 pIgG1-Fc基因的克隆
在安陽工学院实验室取猪的脾脏组织和由外周血分离的细胞研磨、按照TRIzol试剂说明书提取总RNA。按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA第一链，作为扩增pIgG1-Fc基因的模板。
根据GenBank数据库中已公布的pIgG1-Fc基因序列，设计引物并引入2个酶切位点和保护碱基，Fc-F：5′-CGCGGATCCCCCATATGCCCAGGCTGTG-3′（带下划线部分为BamH Ⅰ酶切位点），Fc-R：5′-TCCCAAGCTTGTTTACCCTGAGTCTTGGAG-3′（带下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点），该对引物扩增片段大小约为 666 bp，引物送金维智生物科技有限公司合成。PCR反应体系为50 μL，其中：Premix Taq 25 μL，上、下游引物（浓度 10 pmol/L）各1 μL，cDNA模板2 μL，用灭菌蒸馏水补至 50 μL。反应条件如下：94 ℃ 4 min; 95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40个循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶并纯化。
1.4 重组表达质粒的构建
胶回收纯化的pIgG1-Fc基因片段和载体pET30a（+）均被BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后回收，将回收的目的片段和载体片段按一定的比例在T4 DNA连接酶的作用下于16 ℃连接过夜。将连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α，37 ℃ 温箱培养过夜，挑取单克隆置于37 ℃摇菌12～16 h，提取质粒，将双酶切鉴定为阳性的质粒送金维智生物科技有限公司测序。
1.5 目的基因在大肠杆菌中的表达
将重组质粒pET30a（+）-pIgG1-Fc转化大肠杆菌BL21（DE3），涂布含有卡那霉素的LB琼脂平板，37 ℃温箱培养过夜，挑取单克隆菌落摇菌过夜，将菌液分别按 1 ∶ 100 的比例接种至含有卡那霉素的LB培养液中，37 ℃振荡培养4 h后，将每管菌液平均分成2管，1管加入IPTG至终浓度为 0.5 mmol/L，另一管不加IPTG作为对照，同时设置 pET30a（+） 转化的大肠杆菌BL21（DE3）作为阴性对照。将加入IPTG组和对照组菌液都放入37 ℃继续振荡培养6 h，然后于 12 000 r/min 离心1 min，弃上清，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）重悬菌体沉淀，取 80 μL 加入20 μL 5×loading buffer沸水煮 10 min 制备样品，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。
1.6 重组蛋白原核表达条件的优化
1.6.1 IPTG诱导浓度的优化 将上述过夜培养的阳性菌液按1 ∶ 100的比例接种于含卡那霉素的培养液中，37 ℃振荡培养 4 h，分别加入IPTG至终浓度为0、0.1、0.3、0.5、0.7、09、1.0、1.5、2.0 mmol/L，37 ℃继续振荡培养4 h，同时设置pET30a（+）转化的大肠杆菌BL21（DE3）作为阴性对照。参照“1.5”节进行SDS-PAGE分析。
1.6.2 表达温度的优化 将上述过夜培养的阳性菌液按 1 ∶ 100 的比例接种于含卡那霉素的培养液中，37 ℃振荡培养4 h，分别加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，分别于16、20、25、30、37 ℃继续振荡培养4 h，同时设置pET30a（+）转化的大肠杆菌BL21（DE3）作为阴性对照。参照“1.5”节方法进行SDS-PAGE分析。
1.6.3 表达时间的优化 将上述过夜培养的阳性菌液按 1 ∶ 100 的比例接种于含卡那霉素的培养液中，37 ℃振荡培养4 h，分别加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，于25 ℃分别继续振荡培养3、4、5、6、7 h，同时设置pET30a（+）轉化的大肠杆菌BL21（DE3）作为阴性对照。参照“1.5”节进行SDS-PAGE分析。
1.7 重组蛋白可溶性表达分析
将“1.5”节过夜培养的阳性菌液按1 ∶ 100的比例接种于100 mL含卡那霉素的培养液中，37 ℃振荡培养4 h，分别加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，于25 ℃继续振荡培养6 h，然后于 12 000 r/min 离心1 min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀洗2次，加入10 mL PBS重悬沉淀，置于冰上进行超声，工作3 s，间歇 3 s，超声30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液80 μL，用100 μL PBS重悬沉淀后也取80 μL，分别加入20 μL 5×loading buffer沸水煮10 min制备样品，进行SDS-PAGE分析。
2 结果与分析
2.1 pIgG1-Fc基因克隆
通过反转录和PCR特异性扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，扩增片段大小约为666 bp，与预期片段大小相符（图1）。测序结果进一步表明，PCR扩增基因为 pIgG1-Fc。
2.2 重组质粒的构建
将重组质粒分别用PCR扩增和酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳后，结果显示，PCR扩增条带单一，大小约为666 bp，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切也出现1条约666 bp大小的条带（图2），测序结果进一步证实重组质粒pET30a（+）-pIgG1-Fc构建成功。
2.3 重组蛋白的表达
重组质粒pET30a（+）-pIgG1-Fc转化的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG进行诱导表达，产物经SDS-PAGE分析，可见相对分子量约为36.0 ku的特异性蛋白条带，pET30a（+） 空载体表达对照组没有出现目的条带（图3）。
2.4 表达条件的优化
2.4.1 IPTG最佳诱导浓度的摸索 pET30a（+）-pIgG1-Fc转化的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG终浓度为1 mmol/L、37 ℃ 下诱导表达4 h时，重组蛋白pIgG1-Fc的表达量最高（图4）。
2.4.2 最佳表达温度的摸索 pET30a（+）-pIgG1-Fc转化的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG终浓度为1 mmol/L、25 ℃下诱导表达4 h时，重组蛋白pIgG1-Fc的表达量最高（图5）。
2.4.3 最佳表达时间的摸索 pET30a（+）-pIgG1-Fc转
化的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG终浓度为1 mmol/L、25 ℃下诱导表达6 h时，重组蛋白pIgG1-Fc的表达量最高（图6）。
2.5 重组蛋白可溶性表达鉴定
pET30a（+）-pIgG1-Fc转化的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG终浓度为1 mmol/L、25 ℃下诱导表达6 h时，重组pIgG1-Fc蛋白既在包涵体中表达也在上清中表达，但主要在包涵体中表达（图7）。
3 讨论
Fc段作为免疫球蛋白的恒定区，由物种决定。外源蛋白通过与免疫球蛋白Fc段结合形成融合蛋白可延缓靶蛋白在机体内的降解，Fc与免疫细胞表面受体结合的功能也可加强递呈靶蛋白给免疫细胞、介导融合蛋白穿过胎盘和黏膜屏障、促进抗体依赖细胞介导的吞噬作用及调控抗体依赖细胞介导
的细胞毒作用等多种生物学效应[5，8-11]。人源Fc段形成多种融合蛋白已被大量研究[12-13]，动物源Fc段形成的融合蛋白近些年来也逐渐被关注[14-15]，但大多以真核表达为主，猪源Fc片段的原核表达在国内外鲜有报道。
本研究首先克隆了猪IgG1-Fc片段基因，并构建了原核表达载体pET30a（+）-pIgG1-Fc。在确定该重组质粒能够原核表达后，又对原核表达条件进行了优化，确定该重组质粒在IPTG终浓度为1 mmol/L、25 ℃下诱导表达6 h时，重组蛋白pIgG1-Fc的表达量最高。最后鉴定该融合蛋白的表达不仅存在于上清中，也存在于包涵体中，且主要以包涵体形式表达。该表达所用原核表达载体为pET30a（+），是常用的原核表达载体之一，带有组氨酸标签可用于镍柱纯化融合蛋白。该载体含有肠激酶作用位点，可用于融合蛋白纯化后去除标签等多余氨基酸，表明重组蛋白可方便地用于后续研究。
本研究对猪IgG1-Fc基因的成功克隆和原核表达，为后续研究IgG1-Fc融合蛋白的原核表达，实现工业化大量生产提供了基础，为研究能与猪IgG1结合的二抗提供了抗原材料。
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