打开文本图片集
摘 要 采用左冠状动脉前降支结扎的方法，建立SD大鼠急性心肌梗死（Acute myocardial infarction， AMI）模型，使用超高效液相色谱串联四极杆/飞行时间质谱（UPLCQTOF/MS）代谢组学研究平台对大鼠血浆样本进行代谢轮廓分析，研究复方丹参滴丸对AMI大鼠心肌保护作用机制。经主成分分析和偏最小二乘法分析，筛选并鉴定出22种与AMI相关的差异代谢物，其中的8种能够被复方丹参滴丸显著调节，分别是硫酸对甲苯、马尿酸、雌马酚葡萄糖苷酸、溶血磷脂胆碱（16∶0）、胆酸、油酸酰胺、棕榈酰胺和鞘脂（d18∶1/16∶0）。研究结果表明， 复方丹参滴丸可能是通过调节苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢、胆汁酸代谢及鞘脂代谢通路，发挥抗AMI大鼠心肌损伤的作用。
关键词 复方丹参滴丸； 急性心肌梗死； 代谢组学； 血浆
1 引 言
复方丹参滴丸（Compound danshen dripping pills， CDDP）由丹参、三七和冰片组成，由天士力医药集团股份有限公司自主研发，以治疗气滞血瘀所致的心绞痛、冠心病为主的中药，广泛应用于心血管病和糖尿病血管并发症的治疗[1]。急性心肌梗死（Acute myocardial infarction， AMI）是一类因持久严重的心肌缺血导致冠状动脉急性闭塞，从而引起部分心肌急性坏死的急性缺血性心血管疾病，而复方丹参滴丸可以通过降低心肌耗氧量、改善能量代谢、保護心肌细胞、改善脂质代谢、抗血小板聚集、改善血流动力学、改善微循环障碍、抗氧化和抗炎症等作用， 多方面治疗心血管类疾病[2]。
代谢组学关注于内源性小分子化合物（分子量小于1000）在生物体系受外界刺激（如疾病侵袭、药物干预、环境变化等）所产生的代谢产物应答变化， 目前广泛应用于疾病诊断、药物毒性评价、作用机理研究和基因功能阐明[3，4]。其认识疾病的过程与中医的整体观、系统观和辨证论治不谋而合[5]，从而给中医药复杂理论体系的研究提供了新的思路和方法。目前已有开展复方丹参滴丸代谢组学方面的研究报道， Xin等[6]采用左冠状动脉前降支结扎法（LADCA）制作SD大鼠心肌梗死模型， 使用GCMS检测到血浆和尿液样品中128种代谢物，发现了20种变化较大的代谢产物，主要集中在氨基酸代谢和能量代谢方面。Guo等[7]采用异丙肾上腺素（ISO）法制造SD大鼠急性心肌缺血模型， 使用GCTOF/MS检测大鼠血浆和心肌内源性代谢物，发现心肌缺血后，能量代谢、糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢发生改变，而复方丹参滴丸具有逆转作用。本研究在动物模型制备、样品采集和检测手段方面进行了优化。使用LADCA法造模可排除ISO法中药物本身对于代谢物变化的影响。另外， Xin等[6]的研究发现， LADCA法结扎模型中，大鼠心肌在造模3天时已可见少量纤维化，造模7天时心肌已经明显纤维化，心脏功能已经改变，而复方丹参滴丸对缺血所致心脏功能改变的疗效一般，与其临床适应症有一定差距。本研究采集造模后24 h的血浆样本，更接近典型AMI临床症状的时期。检测手段方面， 采用适于检测心肌缺血造成的氨基酸类、脂类、脂肪酸类等代谢物变化[8，9]的UPLCQTOF/MS方法检测血浆样本。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
SAR1000小动物呼吸机和BO1800动物心电血压监护仪（上海玉研科学仪器有限公司）； RM2235石蜡切片机和激光扫描共聚焦显微镜（德国Leica公司）； DP73显微镜（日本Olympus公司）； DH36001B电热恒温培养箱（天津泰斯特公司）； WatersAcquity超高效液相色谱仪串联Waters SynaptTM G2 QTOF/MS 质谱仪（美国Waters公司）； MilliQ超纯水仪（美国Bedford公司）； Waters Acquity BEH C8色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）； VortexGenie2微型漩涡混合器（美国Scientific Industries公司）； Legend micro 17高速离心机（美国Thermo公司）。
水合氯醛（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司）； 青霉素钠注射液（北京悦康凯悦制药有限公司）； 二甲苯和无水乙醇（分析纯，国药集团）； 苏木精和抗荧光淬灭剂（北京索莱宝科技有限公司）； 甲醇和乙腈（质谱纯，美国Omni Chem公司）； 甲酸（HPLC级，>95%）、Lα溶血卵磷脂（≥99.0%）、3sn溶血磷脂酰乙醇胺（≥99%）、亮氨酸脑啡肽（SigmaAldrich公司）； 三氯乙醇葡糖苷酸钾盐（95%）、硫酸吲哚酚钾盐（98%），加拿大TRC公司； 马尿酸（98%，上海Macklin公司）； 硫酸对甲苯钾盐（99.8%，日本TCI公司）； 琥珀酸、胆酸（98%，中检所）。复方丹参滴丸（天士力医药集团股份有限公司提供）。
2.2 实验动物
SPF级SD雄性大鼠（体重180～220 g，动物许可证编号： SCXK（京）20160011，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供），所有大鼠在实验前供应水和标准饲料3天。
2.3 实验方法
2.3.1 模型建立 LADCA法制作SD大鼠心肌梗死模型[6]，将大鼠用水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉， 固定于手术台上，仰卧位。颈部去毛消毒，手术剪剪开皮肤暴露气管，连接至呼吸机进行机械通气，设置呼吸频率80次/min，潮气量6～8 mL/kg，呼吸比为2∶1， 根据具体呼吸频率及深度适当调整呼吸参数。左前胸去毛消毒，顺肋间隙方向胸骨左侧切开皮肤约1.0～1.5 cm，分离皮下组织和肌肉，入胸后推开胸腺，暴露心脏及大血管根部。剪开心包，在左心耳下缘与肺动脉间可见左冠状动脉前降支起始部，在距离主动脉根部约3～5 mm处，以左冠状静脉为标志，7号丝线穿线结扎造成缺血，逐层关胸，缝合皮肤，术后肌肉注射青霉素25000 U。假手术组大鼠的手术过程与上述相同，但只穿线不结扎。心电图显示ST段显著抬高时， 即表明急性心肌梗死造模成功。
2.3.2 实验分组、给药方案及样本收集 实验大鼠随机分为3组，假手术对照组（Sham）、模型组（Model）和治疗组（Treatment），每组各10只。为研究复方丹参滴丸抗急性心肌梗死作用，治疗组在造模前6天和造模当天，每天灌胃给药，给药剂量根据临床用药剂量折算，以0.8 g/（day·kg）鼠重的剂量，给予复方丹参滴丸。假手术对照组及模型组分别灌胃给予相当剂量生理盐水。实验动物在造模24 h后脱颈处死，眼眶取血1.5 mL，置于涂有肝素的EP管内，3500 r/min离心15 min，于
Symbolm@@ 80℃保存备用。取血后收集心肌缺血区组织（梗死区和正常区中间），用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗去除血细胞后，在液氮中速冻，于
Symbolm@@ 80℃保存备用。
2.3.3 血浆样本前处理 血浆于0℃冰水混合物中解冻，用移液枪精确量取100 μL血浆样品，加入300 μL冰甲醇，涡旋振荡混合均匀2 min，12000 r/min离心5 min，取上清液直接用于液相色谱质谱分析。将所有样品各取50 μL混合作为质控样品（Quality control， QC），包含所有样品的特征，力求反映整体样品的状况，可用于监控整个分析批中样品测定的稳定性。
2.4 样品测定
2.4.1 色谱条件 采用Waters Acquity BEH C8色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.4 mL/min，柱溫35℃，进样量5 μL，梯度洗脱程序： 0～1 min，5% B； 1～5 min，5%～50% B； 5～10 min，50%～80% B； 10～11 min，80%～100% B，11～12 min，100% B，平衡时间为3 min。
2.4.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），在正负两种模式下进行测定，数据采集模式为MSE棒状图（Centroid）模式，交替切换低碰撞能与高碰撞能，可同时获得一级质谱图和二级质谱图[10]。参数如下： 毛细管电压正模式3.0 kV，负模式2.3 kV； 锥孔电压30 V； 离子源温度120℃； 脱溶剂气温度500℃； 锥孔气流量50 L/h； 脱溶剂气流量800 L/h； 碰撞电压范围19～45 V； 采样频率0.1 s； 质量数检测范围m/z 50～1200； 内参校准液使用亮氨酸脑啡肽（＼[M + H＼]+ （m/z 556.2771），＼[M-H＼]-（m/z 5542615）），浓度2 ng/μL，流速10 μL/min。
2.4.3 分析顺序 分析样品前测试空白溶剂样品，保证色谱柱及系统中无残留污染物干扰。连续进样10次QC样品， 用于评估方法的重复性，样品测试顺序随机，并将QC样品穿插于分析样品中作为评估分析批次稳定性的依据。
2.5 数据分析
将所有的液相色谱质谱数据导入Waters 公司Markerlynx 软件（version4.1， Waters Corp， Milford， USA）， 进行色谱峰自动识别提取和峰匹配，将数据结果矩阵以CSV格式导出，再将数据导入Metaboanalyst 3.0 （http：//www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml），对数据矩阵进行归一化（Normalization）、立方根数据转换（Cube root transformation）、Pareto标尺化（Scaling）等处理，以减少变量方差异性，增加数据间的可比性。通过构建非监督主成分分析（Principal component analysis， PCA）， 考察各组血浆样本间整体代谢变化情况； 构建有监督模式的偏最小二乘判别分析（Partial least squaresdiscriminant analysis， PLSDA）模型，鉴别模型中对于区分各组间代谢轮廓差异贡献较大的代谢物，初步筛选出具有潜在可能性的内源性代谢物。
3 结果与讨论
3.1 病理学评价
以心电图（Electrocardiogram， ECG）ST段显著抬高作为衡量造模成功与否的标志。如图1所示，从ECG中对比Sham组可见， 造模后出现ST段显著抬高及病理性Q波，而治疗组虽然依然处于ST抬高状态，但未见明显病理性Q波。
为检测CDDP对组织形态的影响，取造模后心肌组织， 用H&E染色观察心肌组织的形态变化。典型形态如图1所示，Sham组显示了正常状态下心肌组织的形态结构； Model组心肌出现明显损伤，表现为部分心肌纤维结构破坏、心肌细胞间质水肿和少量炎症细胞浸润； 而提前给予CDDP进行干预，造模后心肌组织损伤明显减轻，仅发生少量轻度间质水肿。
3.2 质控样本分析
对建立的UPLCQTOF/MS方法进行稳定性和重复性方法学评价。正负模式下各选择5个不同极性的离子进行方法学评价。分别对选择的10个离子的保留时间和峰面积进行检测（表1）。在正模式下保留时间的相对标准偏差（RSD）<0.22%，峰面积的方法重复性及稳定性评价RSD分别为2.43%～7.14%及1.93%～3.19%； 在负模式下， 保留时间的RSD<0.70%，峰面积的方法重复性及稳定性评价RSD分别为1.28%～2.59%及2.20%～5.93%。以上结果表明， 本方法重复性高，稳定性好，可以用于进行批量的代谢组学实验。
3.3 AMI差异代谢物筛选
在正负模式下， 分别对假手术对照组和模型组的数据建立PCA模型，从得分图（图2）中可以发现两组样品分别聚合到一起， 并得到了明显分离，说明在AMI造模后大鼠血浆中内源性代谢物轮廓发生了显著异常。 将两组数据建立PLSDA模型，使用交叉验证的两个参数R2和Q2进行评价，R2表示模型的方差大小和拟合的优良度，Q2表示模型预测值的方差大小和预测能力。正模式下，R2=0.959，Q2=0944； 负模式下，R2=0.976，Q2=0.957。表明模型具有很好的拟合性和预测能力。根据模型中代谢离子的变量投影重要性参数（Variable importance in the projection，VIP）>1初步筛选差异性变量。对所得差异性变量进行t检验，筛选出两组间相对含量存在显著性差异的变量（p<0.05）。对同时满足VIP>1和p<0.05的变量进行鉴定。
3.4 AMI差异代谢物初步鉴定
利用差异代谢物精确m/z值在HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、METLIN（http：//metlin.scripps.edu/）、KEGG （http：//www.genome.jp/kegg/）、PubChem （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、LIPID MAPS（http：//www.lipidmaps.org/）等數据库检索，结合差异代谢物质谱数据信息（加合离子、准确质荷比、保留时间、MSE二级信息），寻找信息匹配的可能代谢物。查询代谢物的描述信息及相关文献，对物质进行确认。通过标准品对部分物质进行验证，最终初步确定22种差异代谢物（表2），分别分布于甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、三羧酸循环、细胞色素P450代谢、戊糖和葡萄糖醛酸酯互变代谢、苯丙氨酸代谢、花生四烯酸代谢、胆汁酸代谢、脂肪酸代谢等代谢通路中， 表明AMI可能对以上通路造成影响，使整体状态失调。其中，有10种代谢物在模型组中表现为上调，12种代谢物在模型组中为下调。
3.5 复方丹参滴丸对AMI治疗作用的代谢组学分析
本研究采用代谢组学的分析方法，对大鼠血浆中的小分子代谢产物进行测定，从整体水平考察复方丹参滴丸对AMI的保护作用。分别在正负模式下对3组数据建立PCA模型（图3），从得分图中可以看出两种检测模式下复方丹参滴丸治疗组（蓝色）大鼠的整体状态已经偏离模型组（绿色），且有向Sham组（红色）状态靠近的趋势，尽管未与Sham组整体状态相交， 仍可说明复方丹参滴丸的给药对大鼠起到了预保护作用。
为进一步探讨复方丹参滴丸抗AMI的作用机制，对已鉴定的差异代谢物在复方丹参滴丸给药组的含量情况进行研究。从热图（图4）中可以直观地看出差异代谢物在每个样本中的含量高低情况。通过独立样本t检验，比较模型组与治疗组总体之间的AMI差异代谢物含量是否具有显著性差异，保留p<0.05的代谢物。结果表明，复方丹参滴丸可以不同程度地逆转AMI大鼠血浆差异代谢物，对其中的8种代谢物具有较显著的调节作用，分别是硫酸对甲苯（pTolyl Sulfate）、马尿酸（Hippuric acid）、雌马酚葡萄糖苷酸（Equol 7Oglucuronide）、溶血磷脂胆碱（16∶0）（LysoPC（16∶0））、胆酸（Cholic acid）、油酸酰胺（Oleamide）、棕榈酰胺（Palmitic amide）和鞘脂（d18∶1/16∶0）（SM（d18∶1/16∶0）），具体调节情况如图5所示。
以上差异代谢物位于苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、胆汁酸代谢和脂肪酸代谢等代谢通路中，说明复方丹参滴丸可能通过调节这些通路起到保护心肌的作用。
硫酸对甲苯、马尿酸、雌马酚葡萄糖苷酸均属于与尿毒症相关的代谢物[11]，由胃肠道微生物代谢产生，是典型的难解离蛋白结合毒素，这些物质含量的改变体现出胃肠微生物菌群的失调，与心血管疾病和氧化损伤有密切的关系[12]。 本研究发现，经AMI造模后， 这些物质含量失衡，而在复方丹参滴丸治疗组中该情况被逆转，体现出复方丹参滴丸对菌群失调的平衡作用。
溶血磷脂胆碱（Lysophosphatidylcholine， LysoPC）是磷酸卵磷酯（Phosphatidylcholine，PC）经磷脂酶A2（PLA2）作用的裂解产物，PLA2能催化磷酸卵磷酯裂解产生游离脂肪酸，而脂肪酸是内皮细胞和心肌细胞膜的重要成分，是心脏能量来源的主要物质[13]。本研究发现心肌梗死引起磷脂分解代谢紊乱，推测为AMI影响了PLA2的活性。相比Sham组，所测到的疾病状态下含不同长度脂肪酸链LysoPC的变化趋势并不统一，具体原因尚不明确，但在复方丹参滴丸组中均体现出回调趋势，其中以LysoPC（16∶0）最为显著。
胆酸是一种在肝脏中分泌合成的重要胆汁酸，属于类固醇物质。是一种强乳化剂，能促进小肠及肝脏中脂类的吸收代谢与排泄，并可以回到肝脏中被重新利用， 它与胆固醇平衡相关的关键酶调节密切相关。本研究中胆酸水平在治疗组基本被调节至正常水平，证明复方丹参滴丸可能具有改善AMI带来的胆汁酸代谢异常的功能。
油酸酰胺、棕榈酰胺均属于长链不饱和脂肪酰胺，是由机体自然产生内源性物质， 与情绪与睡眠障碍密切相关，属于中枢神经内源性大麻素系统，可与多个神经递质系统相互作用[14]，受体激活可活化血小板、刺激血小板聚集， 并与多种心血管危险因子密切相关[15]，但分子作用机制尚不明确。在治疗组中， 两物质含量水平下调，说明复方丹参滴丸的预给药可以起到调节这类物质代谢平衡的作用。
SM（d18∶1/16∶0）为鞘磷脂类物质，来源于细胞膜周围的一些神经细胞轴突髓鞘，由磷酰胆碱及神经酰胺经鞘磷脂合成酶催化产生，在信号转导过程中发挥重要作用。其与AMI的相关作用机制还需要进一步研究。本研究结果表明， 治疗组降低了AMI带来的SM（d18∶1/16∶0）含量升高的状况。
4 结 论
疾病的病理学变化常会导致机体的基础代谢产生相应改变，从而引起小分子代谢物的种类、浓度、比例等发生变化，最终造成个体间代谢轮廓的差异。代谢组学通过分析生物样本中可以反映机体状况的小分子内源性代谢物，对药物进行整体评价，适合于中药复方多通路、多途径的作用特点。
本研究采用LADCA法制作大鼠AMI模型，采用UPLCQTOF/MS方法对大鼠血浆样本进行测定，以代谢组学为分析手段，研究在复方丹参滴丸给药干预的情况下，AMI大鼠血浆中内源性代谢物变化。结果表明，复方丹参滴丸可以对筛选到的22种AMI差异代谢物中的8种有明显的回调作用，其通路涉及苯丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、胆汁酸代谢及脂肪酸代谢， 表明复方丹参滴丸可以通过多通路、多途径对AMI起到预保护的作用。
References
1 HUANG Xing， KOU GuanJun， WANG BaoHe. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research， 2016， 27（5）： 1187-1190
黄 兴， 寇冠军， 王保和. 时珍国医国药， 2016， 27（5）： 1187-1190
2 LI WenWen， WEI YiDan， WEI LinLin， JI Hui. Pharmaceutical and Clinical Research， 2014， 22（1）： 67-71
李文雯， 韋艺丹， 魏林林， 季 晖. 药学与临床研究， 2014， 22（1）： 67-71
3 Nassar A F， Wu T， Nassar S F， Wisnewski A V. Drug Discov. Today， 2017， 22（2）： 463470
4 LIN He， PI ZiFeng， MEN LiHui， CHEN WeiJia， LIU ZhiQiang， LIU ZhongYing. Chinese J. Anal.Chem.， 2016， 44（11）： 1755-1762
林 贺， 皮子凤， 门丽慧， 陈维佳， 刘志强， 刘忠英. 分析化学， 2016， 44（11）： 1755-1762
5 QIN KunMing， WANG Bin， CHEN LinWei， ZHANG MaoSen， YANG GuangMing， SHU YaChun， CAI BaoChang. China Journal of Chinese Materia Medica， 2014， 39（16）： 3010-3017
秦昆明， 王 彬， 陈林伟， 章茂森， 杨光明， 束雅春， 蔡宝昌. 中国中药杂志， 2014， 39（16）： 3010-3017
6 Xin X， Zou H M， Zheng N N， Xu X C， Liu Y M， Wang X X， Wu H B， Lu L N， Su J， Qiu M F， Wang X Y. EvidenceBased Complement. Alter. Med.， 2013， 2013： 718305
7 Guo J H， Yong Y H， Aa J Y， Cao B， Sun R B， Yu X Y， Huang J Q， Yang N， Yan L L， Li X X， Cao J， Aa N， Yang Z J， Kong X Q， Wang L S， Zhu X X， Ma X H， Guo Z X， Zhou S P， Sun H， Wang G J. Sci. Rep.， 2016， 6： 37919
8 Tan G G， Lou Z Y， Liao W T， Dong X， Zhu Z Y， Li W H， Chai Y F. Mol. Biol. Sys.， 2012， 8（7）： 548-556
9 Fan Y， Li Y， Chen Y， Zhao Y J， Liu L W， Li J， Wang S L， Alolga R N， Yin Y， Wang X M， Zhao D S， Shen J H， Meng F Q， Zhou X， Xu H， He G P， Lai M D， Li P， Zhu W， Qi L W. J. Am. College Cardiol.， 2016， 68（12）： 1281-1293
10 Zhao YY， Lin R C. ChemicoBiol. Interactions， 2014， 215： 7-16
11 Velenosi T J， Hennop A， Feere D A， Tieu A， Kucey A S， Kyriacou P， McCuaig L E， Nevison S E， Kerr M A， Urquhart B L. Sci. Rep.， 2016， 6： 22526
12 Viaene L， Thijs L， Jin Y， Liu Y P， Gu Y M， Meijers B， Claes K， Staessen J， Evenepoel P. PloS One， 2014， 9（5）： e79682
13 Ahn W G， Jung J S， Kwon H Y， Song D K. Inflammation， 2017， 40（2）： 537-545
14 Eric M R. Progress NeuroPsychopharmacol. Biol. Psychiatry， 2008， 32（6）： 1420-1427
15 WANG PengFei. Chinese Journal of Arteriosclerosis， 2010， 18（8）： 669-672
王鹏飞. 中国动脉硬化杂志， 2010， 18（8）： 669-672
Abstract An acute myocardial infarction rat model was established by ligation of the left ventricular coronary artery. Plasma samples of rats were collected and analyzed by ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry （UPLCQTOF/MS） to study the myocardial protection mechanism of compound Danshen dropping pill （CDDP）. After principal component analysis （PCA） and partial least squares discriminant analysis （PLSDA）， 22 metabolites were identified as potential biomarker of AMI. Furthermore， CDDP had remarkable effect on AMI rats. pTolyl sulfate， hippuric acid， equol 7Oglucuronide， lysoPC（16∶0）， cholic acid， oleamide， palmitic amide and SM（d18∶1/16∶0） were significantly changed in treatment group. The results showed that CDDP had a very good myocardial protection effect on AMI rats， and might influence the pathways of phenylalanine metabolism， glycerophospholipid metabolism， fatty acid metabolism， primary bile acid biosynthesis and Sphingolipid metabolism.
Keywords Compound Danshen dripping pills； Acute myocardial infarction； Metabolomics； Plasma
（Received 13 January 2017； accepted 11 April 2017）