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摘 要 以2株新近分离出来的链带藻（Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74）为研究对象，检测胞内主要细胞代谢产物组成及含量变化，找出优势细胞代谢产物。收集相同时间间隔下培养的2株微藻，经过冻干、研磨、复溶，制备成细胞溶解液，再进行逐级萃取，分级检测每个萃取步骤中所得细胞代谢产物的含量。结果表明：在BG11培养基中生长30 d，链带藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的最高蛋白含量分别达到细胞干重的71.68%和62.14%，其他代谢产物，如碳水化合物、脂质和色素，在2株微藻中的含量都没有超过20%。对比其他微藻的文献报道，链带藻Desmodesmus sp. QL96是目前发现的蛋白含量最高的藻株，其蛋白的表达模式和蛋白相关产品的开发具有研究价值。
关键词 链带藻;代谢产物;蛋白;脂质中图分类号 Q949.2 文献标识码 A
Abstract To reveal the dominant cell metabolites， as well as their contents， including carbohydrates， lipids， proteins， chlorophyll and carotenoid of two newly isolated microalgae （Desmodesmus sp. QL96 and Desmodesmus sp. QJ74）. Two microalgae were collected at the dedicated culture time， the cells were lyophilized， ground and resuspended to prepare a cell lysate， and then subjected to stepwise extraction and fractionation to detect the content of the cell metabolite obtained in each extraction step. The results showed that the protein content of Desmodesmus sp. QL96 and Desmodesmus sp. QJ74 reached up to 71.68% and 62.14% of the cell dry weight which were grown in the BG11 medium for 30 days， respectively. The contents of other cell metabolites were much lower， none exceeding 20% of the cell dry weight. Compared to other microalgae in literatures， Desmodesmus sp. QL96 is the most protein abundant microalgae and deserves further study， including protein expression patterns and protein-sourced product development.
Keywords Desmodesmus sp.; metabolites; protein; lipid
DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.024
微藻是單细胞微生物，和其他微生物一样，只有利用显微镜才能分辨其形态特征[1]。微藻种类多样，已经分离鉴定的微藻种属有螺旋藻、小球藻、杜氏藻、红球藻等几万种[1-2]。微藻繁殖速度快、和植物一样可以进行光合作用，是自然界中光合效率最高、生长最为迅速的原始生物种类之一[3]。其细胞代谢产物包括多糖、蛋白质、脂肪酸、色素等多种生物质成分[3]，这些成分的开发利用研究近年来已逐渐成为热点，例如以微藻脂质为原料的生物柴油[4]、以微藻蛋白为主要原料[5]、微藻多糖为主要功效成分的保健品等产品[6-7]的开发研究。然而这些开发项目大多停留在初级阶段，在产业中的应用十分有限，其原因主要是经济成本较高，而经济成本和微藻代谢产物含量的高低直接相关。获得高产生物成分微藻的途径一般有两个，一是筛选天然高产微藻，二是通过基因工程技术提高微藻细胞中部分生物成分的产量。一些通过基因技术建立的工程藻，在实验室生长状态良好，在开放池塘却显示了诸多不适[8]，因而筛选天然高产微藻更加具有可行性。
相关研究发现一些链带藻具有较好的环境适应性，如在新疆沙漠地区分离得到耐干旱的富油链带藻Desmodesmus sp. XJ842[9]，台湾高湿热地区分离得到的高产油能力的链带藻Desmodesmus sp. F2等，这些链带藻对恶劣环境的适应力近年来吸引了广泛的关注。本文以新近从我国西藏高原和云贵高原地区分离出来的2株链带藻为研究对象，以盐水BG11为培养基，利用各种方法检测了藻株细胞中的主要组分，以挖掘其潜在的开发前景和应用领域。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 微藻培养 微藻培养基选用BG11基础培养基[10]。无菌操作条件下，在250 mL的三角瓶中装入100 mL培养基，接入5×107个微藻细胞，在温度（25±1） ℃、光照强度8000 lx、光暗周期12 h∶12 h的培养条件下培养30 d。在设置的时间点上，将微藻通过抽滤的方法收集后再真空冷冻干燥[11]，获得干藻粉，于−20 ℃储存直至测定分析[12]。
1.2.2 生物量的测定 微藻接种后每隔3 d，从每个培养液中抽取10 μL，用血球计数板计数测定Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的细胞数变化情况，剩余的培养液经抽滤和冻干后测细胞干重，绘制2株链带藻的生长曲线。
1.2.3 主要细胞代谢产物的测定 接种后每隔6 d收集一次微藻，冻干后于研钵中磨碎，复悬于25%的甲醇氢氧化钠溶液和pH 7.4的磷酸盐缓冲液混合液（74∶1，V/V）[12-13]，制备细胞溶解液，用以测定其中的总糖、蛋白、脂质、叶绿素和类胡萝卜素的含量。
总糖含量测定：参照Chen等[12]的方法，取上述溶解液0.6 mL，加入1.2 mL经过4 ℃预冷的75% H2SO4，涡旋混合2 min，继续加入2.4 mL蒽酮试剂，于沸水浴下15 min后，迅速冷却至室温，于578 nm下测定吸光度。空白对照取0.6 mL溶解液加入3.6 mL经过4 ℃预冷的75% H2SO4，不加蒽酮试剂测定吸光度。以D-葡萄糖为标品绘制标准曲线。
总蛋白含量测定：蛋白含量以考马斯亮蓝法进行测定[14]。即取500 μL溶解液，于沸水浴25～30 min后，迅速冷却至室温，加入5 mL考马斯亮蓝染液，震荡2 min，混匀后于595 nm下测定吸光度。以BSA为标品绘制标准曲线。
色素含量测定：按Chen等[12]的方法并进行了适当修改，即取溶解液8 mL于沸水浴25～30 min后迅速冷却至室温，与12 mL氯仿甲醇溶液（2∶1，V/V）混合，涡旋混合2 min，离心，取上层水相于416和453 nm测定吸光度，按照公式（1）和（2）分别计算叶绿素a和叶绿素b的含量。取下层有机相于480和430 nm测定吸光度，根据公式（3）计算类胡萝卜素含量。
脂质含量的测定：参照Chen 等[12]的方法，取色素含量测定步骤中分离得到的有机相2 mL，加入1 mol/L三乙醇胺∶1 mol/L乙酸∶6.45%硝酸铜混合液（9∶1∶10，V/V/V）2 mL，涡旋混合2 min，于10000 r/min离心2 min，取下层有机相于260 nm下测定吸光度。对照样本中加入1 mol/L三乙醇胺∶1 mol/L乙酸（9∶1，V/V）2 mL，不添加硝酸铜成分，以棕榈酸为标品绘制标准曲线。
1.3 数据处理
微藻培养的每个预设的时间点都设置3个独立的平行培养，收集的每个样品都进行3次平行的分析检测。采用 Excel 2007和 Origin 8.5软件进行数据分析与图形绘制。
2 结果与分析
2.1 生长曲线的测定
细胞中蛋白含量随时间变化呈一定的波动性（图2B），总的来说在微藻细胞干重的40%～75%。Desmodesmus sp. QL96的蛋白含量随培养时间的延长呈凹字形变化，在接种后第12～24天，蛋白含量处于平缓的低谷，第6和30天的蛋白含量较高，分别是0.717 mg/mg和0.678 mg/mg。Desmodesmus sp. QJ74的蛋白含量变化呈明显的波浪形，在第6、18和30天时较高，而在第12天和第24天时较低，在0.463～ 0.621 mg/mg范围内变化。
2株藻细胞中脂质含量变化趋势如图2C所示，Desmodesmus sp. QL96脂质含量随培养时间延长呈现先上升后下降的趋势，且在培养12 d后Desmodesmus sp. QL96脂质含量达到0.157 mg/mg，之后逐渐下降，而Desmodesmus sp. QJ74中脂质含量始终呈现逐渐下降趋势，从第18天起，2株藻的脂质含量均在0.10 mg/mg左右，在第30天时约为0.086 mg/mg。
Desmodesmus sp. QL96中叶绿素A和B的含量都随培养时间的延长而增加（图2D、图2E），其中叶绿素A的含量在培养第6天时为0.010 mg/mg，每天长势较均匀，在第30天时达到0.023 mg/mg，叶绿素B在0～18 d长势较好，之后在达到0.004 mg/mg后水平保持稳定。Desmodesmus sp. QJ74中叶绿素A的含量随培养时间的延长从0.012 mg/mg降到了0.007 mg/mg（图2D），叶绿素B的平均含量呈现先下降后缓慢上升的趋势，最低为0.002 mg/mg （图2E）。
类胡萝卜素在Desmodesmus sp. QL96中随时间呈现先增后降的趋势（图2F），在第18天达到最大，为0.004 mg/mg，而其在Desmodesmus sp. QJ74的细胞溶解液中没有检出。
2.3 细胞主要代谢产物
对细胞主要代谢成分的检测主要参照Chen等[12]的方法，通过制备细胞溶解液、逐级萃取、分级检测的路径，检测了对数中期（第12天）中每个萃取步骤中所得产物的含量，绘制了细胞代谢产物总图（图3）。
從图3中可见，链带藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74在BG11培养基中25 ℃下生长的主要细胞代谢产物是蛋白质，其含量分别占2株藻细胞干重的56.65%和45.97%。其次是脂质，其含量约占细胞干重的10.50%和11.20%，碳水化合物含量约占细胞干重的7.64%和7.70%。其他细胞代谢物，如叶绿素、类胡萝卜素的含量均小于2.5%。
3 讨论
本文研究了新近分离出来的链带藻Des
Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74的主要细胞代谢物都是蛋白质，在生长的对数中期（第12天），其蛋白含量分别占细胞干重的56.65%和45.97%（图3），然而Desmodesmus sp. QJ74的生物质产率较低（图1），因而总体来说，Desmodesmus sp. QL96的综合蛋白产率更高。其最大蛋白产率0.717 mg/mg（图3B），超过了现有报道中蛋白含量较高的小球藻C. vulgaris（0.6 mg/mg）[19]和极大螺旋藻Spirulina maxima（0.7 mg/mg）[20]。Desmodesmus sp. QL96中的蛋白含量随培养时间呈现先下降后上升的趋势（图2B），而生物质产率/细胞数目则呈现先上升后平缓的趋势（图1），说明细胞增长的过程消耗了细胞内部的蛋白，这可能是由于细胞自身合成的蛋白酶水解了部分蛋白，也可能是细胞代谢过程中消耗了部分蛋白[11]，其中的分子机理仍需进一步研究。
脂类物质是链带藻Desmodesmus sp. QL96和Desmodesmus sp. QJ74细胞中含量第二的成分（图2），然而在2株藻的含量都少于20%（图3C），再者是碳水化合物，而其他组分如叶绿素、类胡萝卜素等的含量均很少。其碳水化合物的含量与同科的冬生栅藻接近[21]，但均低于小球藻[22]、盐生杜氏藻[14]和其他的球绿微藻[14]。
4 结论
新近分离出来的链带藻Desmodesmus sp. QL96蛋白含量可达细胞干重的71.68%，是目前报道的所有微藻中蛋白含量最高的藻种。Desmo-
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