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摘要：根据来源于褐色高温单孢菌（Thermomonospora fusca）YX基因组序列，预测并合成了甘露聚糖酶ManB全基因序列（Accession No. KJ806638），与表达载体pPIC9K重组后，转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115，筛选获得重组菌株ManB-GS115。其酶学性质检测结果表明，该酶最适温度为70 ℃，最适pH为9.0。该甘露聚糖酶ManB在碱性高温环境下有较高的酶活力，可应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域。
关键词：甘露聚糖酶；毕赤酵母（Pichia pastoris）；基因合成；酶学性质
中图分类号：Q19 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）12-2356-03
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.039
Analysis Enzymatic Characterization of A Gene Synthesis of Thermostable and Alkaliphiles Endo-β-1，4-mannanase
WANG Bin1， ZHANG Hua-shan2， XIONG Hai-rong1
（1. College of Life Science，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China；
2.Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）
Abstract：According to the known genomic sequences of Thermomonospora fusca YX and the codon bias of yeast，the optimized mannanase ManB sequence（Accession No. KJ806638） was designed and synthesized. The ManB gene was cloned into the pPIC9K vector，and then expressed in Pichia pastoris GS115 to obtain ManB. The enzymatic properties were shown that the optimal reaction temperature was 70 ℃ and pH was 9.0. With the excellent enzymatic properties，the mannanase ManB could be potentially applied in brewing， food， feed， textileand pharmaceuticals fields.
Key words：mannanase； Pichia pastoris； gene synthesis； enzymatic properties
β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一種能水解含有β-1，4-D-吡喃甘露糖苷键的甘露寡糖和甘露多糖（包含甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等）的内切水解酶。甘露聚糖是植物半纤维素中仅次于木聚糖的第二大组分，广泛分布于植物组织中。β-甘露聚糖酶能将甘露聚糖等多聚糖降解为葡萄糖、甘露寡糖等[1，2]。
随着对β-甘露聚糖酶的深入研究，其应用领域也在不断地扩展，并拥有一个广泛的工业酶应用市场，包括食品和饲料、咖啡萃取、生物乙醇生产、杀黏菌剂、制药、纺织、洗涤、造纸、石油、天然气工业及生物技术等领域[3，4]。来源于细菌的甘露聚糖酶普遍比来源于真菌的甘露聚糖酶具有更高的稳定性，将来源于细菌的甘露聚糖酶基因经序列优化后应用于可高密度培养的毕赤酵母（Pichia pastoris），更适于工业化生产。来源于褐色高温单孢菌（Thermomonospora fusca）的甘露聚糖酶1BQC具有较优良的酶学性质[5]，属于糖苷水解酶类第5家族，其基因大小为906 bp，氨基酸序列大小为302 aa，预测其分子质量为33.1 ku，随着其结晶体三维结构等研究深入，利于进行体外突变等研究。将该酶基因序列优化后，能在毕赤酵母表达系统中高效表达，可在饲料添加剂、保健食品、造纸、洗涤、医药等领域具有广阔的应用前景。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种与质粒 大肠杆菌（Escherichia coli）Top 10菌株由中南民族大学生命科学学院保藏，毕赤酵母GS115和表达载体pPIC9K为中国农业科学院饲料研究所惠赠。
1.1.2 工具酶及试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶等工具酶及DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒DNA小量试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR清洁试剂盒等购自上海AxyPrep公司；底物Locust bean gum from Ceratonia siliqua seeds购于Sigma公司；Tryptone、Yeast Extract购于Oxoid公司；无氨基酵母氮源（YNB）、D-sorbitol、Agar、氨苄青霉素（Ampicillin Sodium Salt）购于Biosharp公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.1.3 培养基 毕赤酵母组氨酸缺陷型选择培养MD，毕赤酵母生长/诱导培养基BMGY/BMMY，大肠杆菌生长培养基LB，毕赤酵母生长培养基YPD等培养基配方见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。
1.2 方法
1.2.1 甘露聚糖酶ManB基因序列的获得 根据序列比对，来源于褐色高温单孢菌甘露聚糖酶1BQC（PDB：1BQC_A）的氨基酸序列与预测甘露聚糖酶的氨基酸序列相似性高达99%。预测该甘露聚糖酶基因序列是褐色高温单孢菌YX基因组序列（CP000088.1：3642249 bp）中一段基因序列。基于巴斯德毕赤酵母密码子使用偏好性，将其中稀有密码子转换为高频表达密码子[6]，同时对照甘露聚糖酶1BQC的氨基酸序列，对预测甘露聚糖酶（AAZ54938.1）基因序列进行密码子优化，获得优化后甘露聚糖酶基因序列ManB已存入基因数据库，编号为Accession No. KJ806638。在优化的甘露聚糖酶ManB基因的3′端添加毕赤酵母偏好的终止子序列，并在5′端和3′端分别引入限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ位点，将该基因序列交武汉擎科创新生物科技有限公司完成全基因合成。
1.2.2 重组载体的构建与异表达 采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切甘露聚糖酶ManB基因和酵母表达载体pPIC9K，连接后转化大肠杆菌Top10，以PCR验证法筛选出阳性克隆菌株ManB-pPIC9K-Top10。
活化菌株ManB-pPIC9K-Top10，并提取质粒ManB-pPIC9K，采用DraⅠ线性化该载体，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞[7]。使用BMGY/BMMY诱导产酶并使用DNS法检测酶活力，依据酶活力高低筛选阳性重组菌株ManB-GS115。
1.2.3 重组甘露聚糖酶酶学性质检测 使用DNS法检测还原糖，测得甘露聚糖酶水解甘露聚糖产生的还原糖含量，对甘露聚糖酶酶学性质进行鉴定。每组均重复3次，取平均值作为最终结果。
1）甘露聚糖酶ManB最适温度的测定。采用DNS法检测甘露聚糖酶最适温度，在pH 5.5的缓冲液下与0.5%角豆胶溶液分别在不同温度下反应15 min，加入 2.5 mL DNS试剂，沸水浴5 min，冷却至室温，加水定容至12.5 mL，于分光光度计中检测OD540 nm。以最高酶活力为100%，计算其他条件下的相对残余酶活力。
2）甘露聚糖酶ManB最适pH的测定。65 ℃时，甘露聚糖酶ManB在不同pH缓冲液条件下准确反应 15 min，测定OD540 nm。
2 结果与分析
2.1 甘露聚糖酶ManB基因序列的获得
将ManB的基因片段连接到pPIC9K上，转化大肠杆菌Top10，获得表达质粒pPIC9K-ManB，测序结果验证重组质粒构建成功。
2.2 甘露聚糖酶ManB的性质分析
结果（图1）表明，ManB的最适反应温度为70 ℃。65 ℃时，甘露聚糖酶ManB在pH 4～10缓冲液条件下反应15 min，结果（图2）表明，在pH 9.0的条件下，相对酶活力最高。
3 小结与讨论
甘露聚糖酶广泛存在于自然界中，在造纸、饲料和食品等工业领域起着重要作用。通过原始菌株发酵产甘露聚糖酶无法满足工业需要，因此使用工程菌表达外源蛋白成为必然。本研究优化了ManB的酵母稀有基因密码子为酵母高表达密码子，主要是替换了原核生物中常见而真核生物中少见的密码子为真核生物中常见的同一氨基酸密码子。ManB来源于褐色高温单孢菌的甘露聚糖酶1BQC，具有较优良的酶学性质，属于糖苷水解酶类第5家族，其基因序列大小为906 bp，氨基酸序列大小为302 aa，预测其分子质量为33.1 ku，ManB的最适温度70 ℃，最适pH 9.0。优化该酶基因序列后，可在毕赤酵母表达系统中高效表达，基于其优良性质，可在饲料添加剂、造纸、医药等领域得到广泛的应用。
参考文献：
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