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[摘要] 目的 比较谷氨酰胺在不同浓度和不同添加阶段的条件下，作为细胞生长液的成分，对乙型脑炎减毒活疫苗生产中金黄地鼠肾细胞的培养效果以及后续生产工艺的影响。方法 ①以两种添加阶段：将谷氨酰胺作为细胞生长液体培养基的成分加入细胞培养和培养细胞时临时配制后加入细胞培养；②以不同的浓度：按0.05、0.1、0.2 g/L的浓度加入细胞培养。结合两种条件后，每种组合条件生产3批地鼠肾细胞，对所有批次细胞的生长情况及后续接种病毒后，对应的病毒生长情况进行比较研究。 结果 谷氨酰胺在培养细胞时临时配制后加入细胞培养所生产的地鼠肾细胞质量优于其作为细胞生长液体培养基的成分加入细胞培养，采用秩和检验，差异有统计学意义（P=0.002<0.05）；谷氨酰胺按0.1 g/L和0.2 g/L的浓度加入细胞培养所生产的地鼠肾细胞质量优于按0.05g/L浓度，在2种添加阶段其，差异有统计学意义（P=0.02<0.05），但0.1g/L和0.2 g/L的浓度之间，无论谷氨酰胺的添加阶段在培养基中添加P=0.513，在培养时临时添加P=0.827），两者差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 在乙型脑炎减毒活疫苗生产所需的地鼠肾细胞培养中，谷氨酰胺适合在培养细胞时临时配制后加入细胞培养容器，浓度不宜低于0.1g/L。
[关键词] 乙型脑炎减毒活疫苗；谷氨酰胺；地鼠肾细胞培养；添加阶段；浓度
[中图分类号] R521.6 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2017）02（c）-0043-03
谷氨酰胺，學名2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，英文Glutamine（Gln），是细胞生长中蛋白质合成必需的编码氨基酸，除了在人体内代谢和免疫中的作用外，国内外文献对其在动物基质培养基中的作用做了明确阐述，可以作为培养基必需的氮源并促进细胞生长和分化。在乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中，用于繁殖乙脑病毒的金黄地鼠肾细胞是贴壁培养的原代动物细胞，该细胞的生长液主要包括通过Medium199（Earle’s）改良后的109液和新生牛血清，谷氨酰胺作为生长液的重要成分。目前谷氨酰胺可以作为细胞生长液体培养基的成分参与细胞培养，或在培养细胞时临时单独配制后参与细胞培养，其添加的阶段和浓度对地鼠肾细胞质量和后续的病毒质量指标有显著影响，因此该研究通过不同浓度及添加阶段的条件下加入谷氨酰胺进行试生产，对谷氨酰胺在乙型脑炎减毒活疫苗生产中的使用方法进行比较研究，期望通过试验得到其在乙型脑炎减毒活疫苗生产中较好的使用方法，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 金黄地鼠 选用同一饲养单元的SPF级金黄地鼠360只，按完全相同的操作步骤进行地鼠处死、肾块采集和剪碎。
1.1.2 地鼠肾细胞 剪碎的地鼠肾在三角瓶内经1%胰蛋白酶液在低温消化20 h后分装成18批地鼠肾细胞。
1.1.3 新生牛血清 市售Hyclone药用级新生牛血清。
1.1.4 109液 通过Medium199（Earle’s）改良后的109液，以Earle’s液为平衡溶剂包含多种氨基酸和乳蛋白等成分[1]。在其他成分相同的情况下，分别制备谷氨酰胺浓度为0.062 5、0.125、0.25 g/L以及不含谷氨酰胺共4种规格溶液，除菌过滤后储存于2～8℃，储存时间持续一周[2]。
1.1.5 乙型脑炎减毒株病毒 SA14-14-2批工作种子批毒种
1.1.6 病毒维持液 市售Gibco MEM液体培养基
1.1.7 谷氨酰胺 市售国药集团化学试剂有限公司
1.2 方法
使用Earle’s液将18批地鼠肾细胞容器内的胰蛋白酶液冲洗干净，按每组3批分为6组（A～F，组内编号1～3），用于谷氨酰胺不同的使用条件。A1组操作如下：在A级层流环境下，将含谷氨酰胺的109液2 000 mL，其中谷氨酰胺含量为0.0 625 g/L，新生牛血清150 mL加入15 L玻璃瓶中，经少量碳酸氢钠调节pH至7.5[3]，加入Earle’s液定容至2 500 mL制成细胞生长液，该生长液中谷氨酰胺终浓度为0.05 g/L[4]。在其中加入一批地鼠肾细胞，经45～50℃水浴2 min后，水平放置于转瓶机上，在36～38℃下，以3～6 r/h培养70 h。
以同样的方法对B～F组进行操作，区别为各组使用的109液和谷氨酰胺含量不同。各组的谷氨酰胺添加条件分别为：A以109液成分加入，浓度为0.05 g/L；B以109液成分加入，浓度为0.1 g/L；C以109液成分加入，浓度为0.2 g/L；D临时配制后加入，浓度为0.05 g/L；E临时配制后加入，浓度为0.1 g/L；F临时配制后加入，浓度为0.2 g/L。
1.2.1 细胞生长情况的观察 生产中期望地鼠肾细胞贴壁生长，在显微镜下轮廓清晰，形态饱满且整体呈现为致密的单层，通过镜检视野内细胞的分布情况将致密度分为50%～75%、75%～90%以及90%以上3档。
1.2.2 病毒生长情况的判定 将培养后的18批细胞瓶内的细胞生长液移除，分别接种乙型脑炎减毒株病毒，加入病毒维持液2 000 mL后置于35～37℃下，以3～6 r/h培养50 h。培养结束后采集各瓶样品运用噬斑法进行病毒滴定检测[7]。
2 结果
2.1 不同时间、不同浓度添加谷氨酰胺后细胞生长情况对比
通过细胞培养后的镜检可见，谷氨酰胺在制备109液时加入，经2～8℃储存一周后进入细胞培养所生产的地鼠肾细胞质量低于培养细胞时临时配制谷氨酰胺加入生长液。另外以0.05 g/L浓度添加谷氨酰胺会显著降低细胞质量，见表1。
2.2 不同时间、不同浓度添加谷氨酰胺后病毒滴度比较
通过病毒滴定实验的检测可见，谷氨酰胺在制备109液时加入，经2～8℃储存一周后进入细胞培养所生产的地鼠肾细胞接种病毒后，病毒生长情况较差，病毒滴度低于临时配制谷氨酰胺加入培养的情况。另外以0.05 g/L浓度添加谷氨酰胺在降低细胞质量的同时，也影响了后续接种病毒后病毒的生长，见表2。
由于乙型脑炎减毒活疫苗病毒滴度是非正态数据，因此采用秩和检验（Mann-Whitney U）对以上数据进行分析。①D、E、F组为临时配制谷氨酰胺加入培养，滴度值与A、B、C 3组相比差异有统计学意义（P=0.002<0.05）；②B、C组和E、F组在谷氨酰胺添加阶段一致的条件下，B、C组滴度高于A组（P=0.02<0.05），同样的E、F组滴度高于D组（P=0.02<0.05）；③B、E组谷氨酰胺浓度为0.1g/L，C、F组谷氨酰胺浓度为0.2 g/L，在谷氨酰胺添加阶段一致的条件下，B和C的滴度差异无统计学意义（P=0.513>0.05），E和F的滴度差异无统计学意义（P=0.827>0.05）。
3 讨论
在乙型脑炎减毒活疫苗的生產流程中，根据谷氨酰胺在不同阶段添加和以不同浓度添加两种条件进行试生产后，对所有批次细胞的生长情况及后续接种病毒后对应的病毒生长情况进行比较。在此项比较性研究中可见，谷氨酰胺在培养地鼠肾细胞时临时配制后加入细胞培养所生产的地鼠肾细胞质量优于其作为液体培养基的成分经储存后加入细胞培养，谷氨酰胺按0.1 g/L和0.2 g/L的浓度加入细胞培养所生产的地鼠肾细胞质量优于按0.05 g/L浓度。分析原因为谷氨酰胺是一种较不稳定的氨基酸，随着时间的推移，会转换成细胞不能利用的形态[5-6]，虽然众多知名进口品牌市售含谷氨酰胺的培养基储存条件为2～8℃，有效期常为数月，但通过试验可见在乙脑减毒活疫苗生产中的地鼠肾细胞培养时，使用谷氨酰胺适宜在培养时临时配制后添加，这样能够更好保持其有效成分帮助细胞生长。另外由于谷氨酰胺是一种条件必需性氨基酸，既是氮源又有组织生长和修补作用[8-9]，在乙脑减毒活疫苗生产中，细胞生长液的谷氨酰胺浓度不宜低于0.1 g/L。传统的哺乳动物细胞培养基Medium199中谷氨酰胺含量即为0.68 mmol/L（约0.099 g/L）[10]，同时考虑到测试结果显示继续提升谷氨酰胺浓度没有显著提升细胞质量，且过多的谷氨酰胺可能会降解导致对细胞有害的氨生成，因此在乙脑减毒活疫苗生产的细胞培养阶段继续提升谷氨酰胺浓度需要谨慎试验并进行更多观察和研究。
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（收稿日期：2016-11-24）