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摘 要：蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是我国常见的食源性致病菌之一。基于PCR技术的快速检测方法在蜡样芽孢杆菌检测中已得到广泛运用，然而该菌在食品中多以芽孢形态存在，常规DNA提取方法难以得到高质量的DNA样本用于qPCR检测。本文对多种DNA提取方法进行比较，结果表明，超声波振荡法能够有效提取蜡样芽孢杆菌芽孢DNA。同时，对实时荧光PCR检测方法进行了改良，将DNA染料叠氮溴化乙锭（EMA）与PCR技术相结合，能够有效消除灭活菌株造成的假阳性结果，提高检测的准确性。
关键词：蜡样芽孢杆菌;超声波振荡法;实时荧光PCR;叠氮溴化乙锭
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种常见的兼性需氧革兰氏阳性致病菌，极易污染乳制品、米饭、水果制品等食品 [1]。目前，检测方法主要是传统培养法，耗时费力，难以适应现代食品生产的检验需要。
蜡样芽孢杆菌实时荧光PCR技术因具有检测时间短、操作简便等优点得到广泛运用。蜡样芽孢杆菌在食品中多以芽孢形态存在，常规DNA提取方法很难从蜡样芽孢杆菌芽孢中提取高质量DNA，对PCR检测的灵敏度造成一定的影响。为提高蜡样芽孢杆菌芽孢DNA提取率，增加实时荧光PCR检测灵敏度，本文采用液氮研磨法等方法进行试验，找出适合的提取方法。
qPCR法检测蜡样芽孢杆菌还有一定的局限性，即不能区分检测到的DNA来自于死细胞还是活细胞，这造成qPCR检测法相对于传统分离培养方法存在假阳性情况。为解决这一问题，相继开发出mRNA检测法、免疫法等活菌检测方法，但都存在着各方面不足[2]。叠氮溴化乙锭（EMA）是一种DNA 插入型染料，能够透过细菌破损的细胞膜与DNA相交联，抑制PCR反应的进行。EMA与PCR相结合，可以精确地检测样品中活菌的存在[3]。本文将EMA运用到蜡样芽孢杆菌实时荧光PCR检测中，提高qPCR检测的准确度，降低假阳性率。
1 材料和方法
1.1 菌种
蜡样芽孢杆菌CMCC（B）63301。
1.2 仪器设备
ABI 7500FAST实时荧光PCR仪、生物安全柜、超声波细胞破碎仪、显微镜。
1.3 蜡样芽孢杆菌芽孢的制备
蜡样芽孢杆菌芽孢形成可以通过营养限量进行诱导，在培养基中添加Mn2+能提高芽孢的得率及稳定性。孔雀石绿染色镜检芽孢生成情况。蜡样芽孢杆菌标准菌株活化后，接种到营养肉汤中，培养三代后，取新鲜培养的菌液接种到含Mn2+营养琼脂培养基（蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，MnSO4﹒H2O 5 mg，加水至1 000 mL，pH 值为7.2），30 ℃分别培养24、36、48、60 h，观察芽孢生成情况。
1.4 芽孢DNA提取
蜡样芽孢杆菌接种到Mn2+营养琼脂培养基中，30 ℃培养60 h。挑取单个菌落到1 mL灭菌水中，12 000 r/min离心2 min，弃上清，收集菌体，用于下步DNA提取。
1.4.1 液氮研磨法
在收集菌体的离心管中加入液氮冷却，使用研磨棒进行研磨，重复上述操作2次，加入500 μL无菌水，涡旋30 s，12 000 r/min 离心 2 min，取上清用细菌DNA提取试剂盒提取DNA。
1.4.2 溶菌酶法
向收集菌体的离心管加入500 μL无菌水，涡旋30 s，再加入1 μL溶菌酶（100 mg/mL），37 ℃水浴2 h，12 000 r/min离心2 min，取上清提取DNA。
1.4.3 煮沸法
在菌体中加入 500 μL 无菌水，涡旋30 s，置95 ℃水浴 5 min，12 000 r/min 离心2 min，取上清提取DNA。
1.4.4 超声波破碎法
向离心管中加入 500 μL 的无菌水，涡旋30 s，放入超声波细胞破碎仪超声波振荡20 min（40%，5 s，5 s），12 000 r/min 离心 2 min，取上清提取DNA。
1.5 EMA使用浓度优化
用ddH2O 配制 0.1 mg/mL 的 EMA 溶液，-20 ℃避光保存。取Mn2+营养肉汤中30 ℃培养48 h的蜡样芽孢杆菌菌液于80 ℃水浴中处理20 min，灭活营养体细胞。将EMA（0.1 mg/mL）分别加入装有1 mL上述灭活菌液的离心管中，使EMA 终质量浓度分别达到 0.1、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL，不加EMA的菌液作为对照。充分混匀后，将离心管黑暗中室温放置约5 min，让EMA与细菌DNA充分结合。然后將离心管放置冰上，强光下曝光 20 min，以此为模板采用超声波破碎法提取DNA。
1.6 EMA 光照时间优化
添加EMA到1.5中所述灭活菌液1 mL离心管中，使每管 EMA终浓度达到 2.0μg/mL。充分混匀后，将离心管黑暗中室温放置 5 min。然后将离心管放置冰上，分别强光下曝光 0、1、5、10、20、40 min，不加EMA的菌液作为对照。以此为模板采用超声波破碎法提取DNA。
1.7 荧光定量PCR检测
利用Primer Express 3.0软件，根据蜡样芽孢杆菌pc-plc基因序列，设计引物和探针（南京金斯瑞生物公司合成）。上游引物： 5’-AAAGATTGGTTCGTGAGAGC-3’;下游引物：5’-CGCTTACCTGTC
ATTGGTG-3’;探针：5’FAM-ACAAGAATATGCAGAT
AAATGGCGCGCTG- TAMRA 3’，扩增条带大小163bp。
PCR反应体系：Premix Ex Taq 12.5 μL，引物各0.5 μL，探针1 μL，模板DNA5 μL，无菌水补足25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，58 ℃ 40 s，40循环。
1.8 人工污染实验
将蜡样芽孢杆菌接种到10 mL鲜牛奶中，37 ℃分别培养24、36、48、60、72 h，80 ℃水浴20 min杀死营养体细胞，在热处理前后分别吸取1 mL样品涂布到MYP培养基上计数。将热处理后的样品分设为EMA处理组（10.0 μg/mL EMA黑暗放置5 min，光照10 min）和无EMA处理，再使用超声波破碎法提取样品蜡样芽孢杆菌芽孢DNA，进行qPCR检测。
2 结果与分析
2.1 芽孢的制备
蜡样芽孢杆菌含Mn2+离子的培养基中培养24、36、48、60 h时，芽孢的生成率分别为0%、41.6%、77.3%、90.1%。培养60 h后，90%以上的细菌形成芽孢，适合下一步实验使用。
2.2 DNA提取方法不同对实时荧光PCR的影响
使用4种不同方法提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR，结果如图1所示。液氮研磨法和煮沸法提取的DNA经qPCR扩增，Ct值分别为21.78和29.54。超声波破碎法提取的DNA进行qPCR扩增，Ct值为18.29，小于其他2种方法。溶菌酶法不能提取芽孢中的DNA。结果表明，超声波破碎法得到的DNA质量要明显强于煮沸法和液氮研磨法。
2.3 EMA使用浓度优化
实验结果如图2所示：不加入EMA处理的样品Ct值最低为18.64，随着EMA浓度的增加，Ct值也逐渐增加。低浓度EMA（0.1～1.0 μg/mL）处理对Ct值得影响不大，仅有略微上升。稍高浓度EMA（2.0～10.0 μg/mL）处理使得Ct值有显著的上升。10.0 μg/mL以上高浓度EMA处理Ct值就不再升高。EMA浓度过低不能全部去除死菌DNA的干扰，出现“假阳性”结果，EMA处理浓度控制在5.0～10.0 μg/mL之间较为适宜。
2.4 EMA 光照时间优化
可见光照射使EMA分解从而不能抑制PCR扩增。若光照时间不足，则EMA不能被完全钝化，影响PCR反应进行，出现“假阴性”结果。如图3所示，EMA处理的样本在不进行光照时Ct值远高于对照组，为36.77;随着光照时间的延长，Ct值逐渐下降，光照10 min时达到最小值24.11;光照10 min以后再延长光照时间则对PCR结果没有任何影响，Ct值稳定在24.10左右。实验结果表明，光照时间控制在10 min左右是较好的选择。
2.5 人工污染實验结果
将蜡样芽孢杆菌接种到新鲜牛奶中，37 ℃培养72 h，再80 ℃热处理20 min，测定热处理前后的菌数，热处理前的菌量可以视为牛奶中总的含菌量，加热灭菌后菌量则为芽孢含量，实验结果见表1。无EMA处理的PCR结果受到死细菌DNA的影响，Ct值与活菌量之间没有明显的相关性;经EMA处理后PCR结果不再受到死细菌的干扰，与细菌芽孢数呈明显的负相关性，随着芽孢数量的增加而降低。
3 讨论
PCR检测蜡样芽孢杆菌芽孢中，常规DNA提取方法难以提取芽孢DNA，导致PCR检测灵敏度偏低，假阴性率较高。本实验比较煮沸法、液氮研磨法、超声波破碎法、溶菌酶法等4种不同方法提取芽孢DNA效果。其中，超声波破碎法效果最佳，所得DNA浓度明显高于其他。EMA处理能有效去除复杂样本中死菌DNA，提高蜡样芽孢杆菌芽孢检测准确率。对蜡样芽孢杆菌样本进行10.0 μg/mL浓度EMA处理及10 min光照，能够得到较为理想的检测结果。通过对牛奶进行人工添加蜡样芽孢杆菌实验结果也支持上述结论，进行EMA处理的PCR结果与芽孢数呈明显的负相关性，而未进行EMA处理的PCR结果受到死细菌DNA的严重干扰，不能准确地反映细菌总量，并且容易出现假阳性的情况。
参考文献
[1] Hiroshi F， Yoshie T， Ryotaro S. Duplex Real-time SYBR Green PCR assays for detection of 17 species of food or waterborne pathogens in stools [J].J Clinical Microbial.2003，41（11）：5134.
[2] LEE J M， LEVIN R E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction[J]. Journal of Microbiological Methods， 2006， 67（3）：456-462.
[3] NOCKER A， CAMPER A K. Selective removal of DNA from dead cells of mixed bacterial communities by use of ethidium monoazide[J].Applied and Environment Microbiology，2006，72：1997-2004.
项目基金：南京市科技计划项目“基于3D细胞传感的食源性致病菌毒力非靶向检测技术研究及应用示范”（编号： 201716006）。
作者简介：刘新梅（1979—），女，汉族，江苏淮安人，硕士研究生，副高级工程师。研究方向：食品微生物与生物技术。
通讯作者：杨军（1971—），男，汉族，江苏南京人，本科，研究员级高级工程师。研究方向：食品安全检测。