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摘要：【目的】分析油茶組培苗不定根发生过程中酶的变化规律，为油茶种苗培育提供参考依据。【方法】以广西主栽油茶无性系岑软2号油茶、桂无1号油茶和桂普24号油茶组培苗为材料，测定其生根过程中过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性。【结果】岑软2号和桂无1号油茶组培苗易生根，培养至50 d生根率大于84.0%，而桂普24号油茶组培苗培养至50 d生根率仅52.7%，属难生根无性系。在组培生根过程中，岑软2号和桂无1号油茶的POD、PPO和IAAO活性在根原基诱导期均呈急剧上升的变化趋势，在根原基形成约20 d达最高峰；桂普24号油茶的POD活性在整个生根期变化不明显，PPO活性明显低于岑软2号和桂无1号油茶，IAAO活性前期不断降低，有利于吲哚乙酸（IAA）的累积，容易形成愈伤组织。【结论】油茶组培苗生根诱导前期提高其POD、PPO和IAAO活性，有利于根原基的诱导，生根诱导后期降低其POD、PPO和IAAO活性有利于不定根伸长。生产上培育油茶组培苗时在培养基中调整外源激素和外源酚等物质的用量可提高组培苗的生根率。
关键词： 油茶；组培苗；不定根；过氧化物酶；多酚氧化酶；吲哚乙酸氧化酶
中图分类号： S794.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）08-1344-05
Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to study change law of enzyme in the adventitious root formation of Camellia oleifera Abel. tissue-cultured plantlets， in order to provide theoretical basis for breeding C. oleifera plantlets. 【Method】Using the tissue-culture plantlets of different C. oleifera clones viz.， Ceuan 2， Guiwu 1 and Guipu 24 as materials， the activities of peroxidase（POD）， polyphenol oxidase（PPO） and indoleacetic acid oxidase（IAAO） were determined in the rooting process. 【Result】The tissue-cultured plantlets of Ceuan 2 and Guiwu 1 were easy to root， their rooting rate were more than 84.0% after being cultured for 50 days， but the rooting rate of Guipu 24 was only 52.7%， so Guipu 24 was difficult to root. The POD， PPO and IAAO activities of Ceuan 2 and Guiwu 1 showed a sharp upward trend during the root primordium induction period， and which reached up to peak about 20 days after root primordium formation. Furthermore， the POD activity of Guipu 24 didn’t change significantly during the whole rooting period， which was significantly lower than those of Ceuan 2 and Guiwu 1. And IAAO activity of Guipu 24 were reduced continuously at the early stage of root primordium formation， which was beneficial to accumulation of IAA and led to callus formation. 【Conclusion】The POD， PPO and IAAO activities of C. oleifera tissue-cultured plantlets are increased at the early stage of rooting induction， which is beneficial to induction of root primordium. However， their POD， PPO and IAAO activities are decreased at the later stage of rooting induction， which is beneficial to elongation of adventitious root. Furthermore， the rooting rate of tissue-cultured plantlets is improved by adjusting dosage of exogenous hormone， exogenous phenols and so on.
Key words： Camellia oleifera Abel.； tissue culture plantlet； adventitious root； peroxidase； polyphenol oxidase； indoleacetic acid oxidase
0 引言
【研究意义】油茶（Camellia oleifera Abel.）是山茶科山茶属植物中种子油脂含量较高且具有一定经济栽培价值的植物总称，主要分布于长江以南广大区域，是我国南方重要的木本食用油料树种（庄瑞林，2007）。茶油是我国2亿多人口的主要食用油之一，油茶产业的发展已上升为国家发展战略，国家油茶产业发展规划也要求2009～2020年新造油茶林165万ha（国家林业局，2009）。短期内发展如此大面积油茶人工林，良种苗木供应不足已成为影响油茶发展最关键的问题，而植物组织培养技术可在较短时间内培育大量遗传稳定性好的优质种苗，是解决这一问题的有效途径（吴幼媚等，2013），但目前油茶组培苗的生根机理尚不清楚，油茶再生体系的建立尚缺乏基础理论支持。因此，测定分析与油茶不定根形成相关的酶活性，对我国油茶产业发展具有重要意义。【前人研究进展】油茶组培研究始于20世纪80年代，颜慕勤和陈平（1980）首次采用油茶子叶的基部诱导出胚状体并形成了油茶再生植株，之后陆续有科技人员开展油茶组培相关技术研究并取得了一定进展。毕方铖等（2004）以油茶优良无性系湘林4号的茎段、幼胚和子叶为外植体，王以红等（2011）用油茶无性系岑软3号的顶芽和茎段芽为外殖体进行组织培养，均能诱导出不定芽和不定根形成再生植株。王瑞等（2013）研究发现，可溶性糖和可溶性蛋白含量的积累是油茶扦插生根的营养基础，过氧化物酶活性在愈伤组织形成期和不定根诱导期最高，有利于根原基的诱导。唐国涛等（2014）进行油茶组织培养生根试验，已筛选出适合油茶生根的培养基，并利用细沙作基质获得了较高质量的油茶生根植株。【本研究切入点】目前，很多单位开展了油茶组培育苗培养材料和培养基的筛选研究，而关于油茶组培苗不定根形成的生理生化基础研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】在建立油茶组培再生体系的基础上，测定分析油茶组培苗不定根形成过程中酶的变化规律，探索油茶组培苗不定根形成的调控机理，为培育油茶种苗提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为我国南方地区主栽的3个油茶无性系岑软2号、桂无1号和桂普24号的无菌试管苗，均由广西林业科学研究院生物研究所提供。
1. 2 试验方法
选择3个油茶无性系高度均约4.0 cm的继代芽接种至同一生根培养基（1/2ER+0.5 mg/L ABT6+2.0 mg/L IAA+0.8 mg/L NAA+40.0 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂）中培养，每个无性系接种60瓶，每瓶10株单芽。培养环境为：温度（28±2）℃，光照强度2500～3500 lx，每天光照12 h。在生根培养基中培养10 d后进行第1次取样，之后每10 d取样1次，共取5次样，每次每个无性系取40株生根苗，剪取长约1.0 cm茎基部分别测定过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性。POD活性采用愈创木酚法（张志良和瞿伟菁，2003）测定，PPO活性采用邻苯二酚比色法（朱广廉等，1990）测定，IAAO活性采用二氯酚比色法（张志良和瞿伟菁，2003）测定。
1. 3 统计分析
采用Excel 2007进行数据和图表处理，采用SPSS 20.0进行统计分析，Duncan’s新复极差法进行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 油茶不同无性系组培苗的生根差异
油茶不同无性系组培苗在生根培养基中生根差异较明显。其中，岑软2号油茶在培养至25～30 d可从外观上看到根点形成，培养至50 d大部分已生根，生根率达93.5%（表1），显著高于其他无性系（P<0.05），根多且细长；桂无1号油茶培养至25～30 d，70.0%以上单芽长出根点，培养至50 d时大部分已生根，但根较细弱；岑软2号和桂无1号油茶小苗基部无愈伤组织形成，不定根主要从皮部生出，属皮部生根，为较易生根无性系；桂普24号油茶培养至20 d时，芽基部形成的愈伤组织膨大，培养至40 d时小部分苗基部在愈伤组织出现根点，培养至50 d时生根率仅52.7%，为各处理最低，生根的单芽仅有1～2条根，根系短粗且有玻璃化现象，生根过程先形成愈伤组织，之后从愈伤组织分化出不定根，属愈伤组织生根，为较难生根无性系。
2. 2 油茶组培苗生根过程中POD活性的变化
从图1可以看出，3个油茶无性系在组培苗不定根发生过程中，POD活性呈先升高后下降再缓慢升高的规律性变化。其中桂普24号油茶组培苗的POD活性在接种20～30 d时达最大值，但因属芽基部形成愈伤组织，POD活性在整个生根诱导过程中变化相对平缓，变幅不大。岑软2号和桂无1号油茶组培苗接种至生根培养基后，POD活性从接种第10 d开始迅速上升，培养至20 d时达最大值；培养至20 d后POD活性急剧下降，由此推测这两个无性系的不定根形成前期，POD活性的上升变化趋势即为不定根分化的标志；培养至25～30 d从苗的基部可见根点出现，组培苗进入不定根伸长期；培养至40 d后POD活性又开始缓慢上升，这时期在油茶组培苗的根部可见二级侧根形成。
2. 3 油茶组培苗生根过程中PPO活性的变化
从图2可以看出，3个油茶无性系的组培苗在整个生根诱导过程中PPO活性均呈现先上升后下降的变化趋势。其中，岑软2号和桂无1号油茶的PPO活性变化趋势基本一致，從接种第10 d开始急剧上升，培养至20 d时达到峰值，峰值维持到培养30 d后快速下降；桂普24号油茶组培苗的PPO活性培养至10～30 d变幅不大，培养至30 d后才缓慢上升，在培养至40 d时达最大值，这时可看到从组培苗基部的愈伤组织处有部分根点形成。说明PPO活性升高对油茶组培苗不定根的诱导和生长有一定促进作用。从图2还可以看出，在培养的前40 d较易生根无性系岑软2号和桂无1号油茶组培苗的PPO活性均明显高于较难生根无性系桂普24号油茶，表明PPO活性高低是油茶组培苗生根难易的标志之一，PPO活性高则较易生根。
2. 4 油茶组培生根过程中IAAO活性的变化
IAAO为植物体内一种含铁的血红蛋白，能氧化分解IAA，调节植物体内IAA的水平，进而影响植物的正常生长发育。从图3可以看出，岑软2号油茶组培苗的IAAO活性变化趋势与桂无1号油茶基本一致，从培养的第10 d开始IAAO活性不断上升，培养至20 d达最大值，这时期是两个无性系不定根的诱导期，IAAO活性升高对油茶根原基诱导有一定的促进作用；培养至20～40 d，IAAO活性出现小幅度下降后又开始缓慢上升，培养至40 d后呈明显下降趋势，整个生根过程呈现上升—下降—上升—下降的变化规律。桂普24号油茶组培苗的IAAO活性在培养第10 d时明显高于其他无性系，在培养至10～20 d时有一个缓慢下降过程，培养至20 d后IAAO活性不断升高，培养至40 d时达峰值后开始下降，其变化趋势为下降—升高—下降。说明易生根无性系油茶的IAAO活性变化规律与难生根无性系存在差异。
3 讨论
本研究中3个无性系油茶组培苗的POD活性均呈上升—下降—上升的变化趋势，但生根率分别为93.5%和84.2%的无性系岑软2号和桂无1号油茶的POD活性在整个生根过程中变幅较大，而生根率较低的无性系桂普24号油茶的POD活性变幅相对平缓。吴幼媚等（2013）对油茶组培苗进行生根细胞学观察发现，根原基在培养至16～19 d时形成，培养至25～30 d可从外观上看到根点形成。本研究中岑软2號和桂无1号油茶组培苗培养至25～30 d其苗的基部可见根点出现，由此推测，本研究中油茶组培苗生根培养的前20 d其POD活性升高，可能是因为产生了某些物质诱导了根原基形成，培养至20 d后其POD活性迅速下降，根原基开始形成、生长，形成不定根。这与王瑞等（2013）对油茶扦插苗的研究结果相似，即在根原基诱导期POD活性上升，不定根形成后POD活性降低，有利于根的伸长。桂普24号油茶虽然在培养的前20 d其POD活性提高，但提高幅度不明显，体内的诱根物质浓度过低，导致仅形成愈伤组织而未进行明显的生根分化。
本研究结果表明，岑软2号和桂无1号油茶的PPO活性在培养初期急剧上升，在根原基形成期和生长期（生根培养至20～30 d）保持在高峰值，然后PPO活性开始下降，与宋丽红和曹帮华（2005）对光叶楮（Broussonetia papyrifera）的研究结果基本一致。PPO活性升高不断催化IAA与酚类物质形成生根辅助因子IAA-酚酸复合物，诱导根原基的生成，之后生根辅助因子保持在一个高浓度水平，促进不定根形成。秦永建等（2009）、王小玲等（2014）研究四倍体刺槐（Tetraploid Robinia pseudoacacia）和刺槐（R. pseudoacacia）扦插生根与PPO活性关系发现，易生根插穗的PPO活性一般高于难生根插穗，本研究也获得了与其相似的研究结果。难生根无性系桂普24号油茶组培苗的PPO活性在整个生根期基本低于易生根的两个油茶无性系，可能是PPO活性较低，催化形成的IAA-酚酸复合物浓度无法诱导根原基形成。
两个易生根油茶无性系岑软2号和桂无1号油茶组培苗在培养至20 d时其IAAO活性达最高峰，这个时期可能是因为IAAO氧化分解IAA使IAA的水平降低，有利于根原基诱导，而培养至20 d后IAAO活性下降，IAA不断积累，有利于不定根的生长。较难生根无性系桂普24号油茶组培苗先形成愈伤组织再从愈伤组织分化出根，可能因为培养前期IAAO活性不断降低，IAA浓度升高进而促进愈伤组织的分化。这与曹帮华等（2008）、刘玉民等（2010）研究发现高活性的IAAO使内源IAA水平降低，低含量IAA有利于生根，以及在表达期IAAO活性降低使得植株内源IAA含量升高，高含量的IAA能促进根生长的结论一致。
油茶组培苗不定根诱导、生长与POD、PPO和IAAO 3种酶活性的变化有着密切关系，而酶活性受环境条件和外源物质的影响，因此，今后在开展油茶无性系组培快繁的实践中可根据酶活性的变化规律，通过控制环境条件和在常规油茶生根培养基中额外添加适量外源激素和外源酚等物质来影响酶活性变化，进而调控组培苗生根，提高生根率，但其调控效果还有待进一步试验证实。
4 结论
本研究结果表明，油茶组培苗的POD、PPO和IAAO活性变化导致不同无性系的生根差异，生根诱导前期提高POD、PPO和IAAO活性，有利于根原基的诱导，生根诱导后期POD、PPO和IAAO活性降低有利于不定根伸长。因此，生产上培育油茶组培苗时在培养基中调整外源激素和外源酚等物质的用量可提高组培苗的生根率。
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（责任编辑 思利华）