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摘要：以不同树龄油茶的叶片为试验材料，研究不同树龄油茶叶片的叶绿素含量、渗透调节物质含量及抗氧化酶活性的变化状况，分析叶片生理指标随树龄的变化规律。结果表明，在不同树龄的油茶树中，二年生叶片的叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）和Chl a+Chl b含量均显著高于一年生叶片;古树二年生叶片的Chl a、Chl b、Chl a+Chl b含量最高，分别为1.57、0.12、1.69 mg/g;在不同树龄的油茶树中，二年生叶片中丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量均高于一年生叶片中的含量;在古树中，一年生叶片中的MDA和H2O2含量分别为13.61 nmol/g、131.06 μg/g，均高于壮龄树和幼树;在古树中，一年生叶片中的脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量均偏高，部分渗透调节物质随树龄越低而逐渐减少，且低于二年生叶片中的含量;在壮龄树中，二年生叶片中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性均高于一年生叶片，且古树叶片中的SOD、POD和CAT活性均明显强于壮龄树和幼树。油茶古树有较高的酶活性，能有效清除植物衰老过程中自身代谢所产生的活性氧（ROS）等物质，使古树依然保持着正常的生理代谢活动。
关键词：油茶古树;抗衰老;叶片;叶绿素含量;生理特性
中图分类号： S794.401 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）22-0188-03
植物衰老指植物的某个器官或整个植株生命功能的衰退并最终导致其自然死亡的一系列变化过程，是植物生长发育周期中一个重要的生理现象[1]。植物衰老过程受到多种因素的影响，生物因素包括植物竞争关系、自身基因等[2]，非生物因素主要包括不良外界环境导致的干旱、盐碱、高温、低温以及重金属等胁迫逆境[3-4]。叶片是植物重要的生长器官，植物衰老的主要外部特征表现是生长速率下降、叶片变黄、脱落，生理特性表现是叶片中氮（N）、磷（P）、钾（K）、铜（Cu）等含量降低，钙（Ca）、镁（Mg）等含量增加[5]。在生命周期的不同阶段，随着年龄的增加，植物生长速率降低，抗逆性能力下降，光合作用减弱，细胞内一系列抗氧化酶表现出动态变化。对古树而言，在细胞器中发生的渐进性功能衰退及细微的结构变化，都会直接影响古树的代谢平衡，干扰古树的正常生长，其中叶片的衰老是程序性细胞死亡的特殊退化过程[6]。植物叶片中叶绿素含量的高低和降解的速率可作为衡量植物衰老与否和衰老快慢的重要标志[7];同样，随着叶片中磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化酶活性的降低，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）等保护酶活性的降低以及可溶性蛋白含量、可溶性糖含量等部分渗透调节物质浓度的降低，作为植物衰老指标的丙二醛（MDA）含量会增加，进而加速其衰老进程。
目前，国内外关于植物衰老的生理特性研究很多，并取得了一些成果。孙艳等发现，MDA含量、相对电导率（REC）及POD活性随黄瓜叶片逐渐衰老而显著升高，光合色素含量、可溶性蛋白质含量、SOD与CAT活性显著降低[8]。在古油松衰弱衰老树中，针叶长度、叶绿素含量、MDA含量及SOD活性等生理指标均不及幼树[9]。朱利君等对珙桐叶的研究发现，珙桐叶POD活性和MDA含量對生长期敏感，同树龄同叶位的珙桐叶随叶片的生长和衰老，POD活性和MDA含量逐渐升高，且不同树龄、叶位、层次的POD活性和MDA含量存在差异[10]。薛秋华等发现，古槐叶片中N、P、Mg元素含量低于幼槐，Ca、铁（Fe）、锰（Mn）含量则高于幼槐，K元素含量在古槐和幼槐叶片中基本相同[11]。
关于植物衰老指标的研究有很多[12-14]，这些研究能够从生理特性方面揭示植物衰老进程，为古树复壮、更新、濒危树种的保护等研究提供一定的参考。油茶作为我国特有的木本油料树种，生命周期长达数百年。目前，关于油茶的研究主要集中在高效栽培[15-16]、育种[17-18]、繁育及加工利用[19]等方面，关于油茶古树衰老中光合色素、酶活性等生理特性的研究相对较少。本研究通过测定不同树龄油茶叶片的相关生理指标，如叶绿素、抗氧化系统酶、部分渗透调节物质等，比较不同树龄油茶的叶片生理生化指标与树龄之间的差异，以期明确油茶古树抗衰老的生理特性，为油茶古树的树势评价、日常养护管理以及复壮、保护等提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验区概况
研究地位于湖南省林业科学院试验林场（113°01′30″E，28°06′40″N）。该区域属亚热带季风湿润气候，年平均气温17.5 ℃，年日照时数为1 841.8 h，年平均降水量为 1 378 mm，年平均相对湿度为81%;土壤系第四纪红色黏土网纹层母质发育的酸性红壤，pH值在4.5～5.5之间。
1.2 供试材料
于2017年6月中旬，选择生长健壮、长势良好的油茶幼树（6年）、壮龄树（30年）、古树（>100年）的优良单株进行采样。在6月下旬，分别采取每个单株树冠外围中上部受光相对一致、健壮、无病变损伤的一年生和二年生功能叶片作为试验材料（3个生物学重复）。采集的叶片装入塑封袋并编号，迅速放入冰盒并带回实验室，用去离子水擦洗干净后，置于-70 ℃冰箱中保存备用。
1.3 指标测定方法
叶绿素含量的测定采用丙酮浸提法;超氧化物酶活性的测定采用核黄素-氮蓝四唑（NBT）光还原法;过氧化物酶活性的测定采用愈创木酚法;过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法;脯氨酸含量的测定采用茚三酮显色法;可溶性糖含量的测定采用比色法;可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法;丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法;过氧化氢含量的测定采用三氯乙酸比色法。叶片相关生理生化指标的测定均重复3次。
1.4 数据分析
用Excel 2003对原始数据进行整理、作图，用SPSS 16.0对数据进行统计与方差分析。同一树龄不同年龄叶片的生理指标差异显著性采用成对t检验法，不同树龄同一年龄叶片的生理指标差异显著性采用单因素方差分析，多重比较采用最小显著差异法。
2 结果与分析
2.1 油茶叶片中叶绿素含量的变化
不同树龄油茶叶片的叶绿素含量存在明显差异（表1）。从树龄看，除幼树Chla含量外，3种树龄油茶的二年生叶片Chl a、Chl b和Chl a+Chl b的含量均显著高于一年生的叶片。其中，油茶古树的二年生叶片Chl a、Chl b和Chl a+Chl b 的含量分别为1.57、0.12、1.69 mg/g，分别比一年生叶片高0.45、0.03、0.48 mg/g。
3种树龄油茶的一年生油茶叶片中，叶绿素含量随树龄的增加均呈现先降后增的趋势。古树叶片的Chl a、Chl a+Chl b含量最高，分别为1.12、1.21 mg/g，其次为幼树和壮龄树。而在二年生油茶叶片中，叶绿素含量随树龄的增加而升高，古树的Chl a、Chl b、Chl a+Chl b含量均显著高于壮龄树和幼树，分别是幼树的1.78、1.09、1.71倍。
2.2 油茶叶片中MDA、H2O2含量的变化
3种树龄油茶的二年生叶片的MDA和H2O2含量均显著高于一年生叶片的含量;其中，古树的二年生叶片中MDA含量最高，为22.88 nmol/g，是一年生叶片含量的 1.68 倍;壮龄树二年生叶片中H2O2含量最高，为416.26 μg/g（表2）。
3种树龄油茶的一年生油茶叶片中MDA和H2O2含量变化趋势一样，均随树龄的增长而增加;古树叶片中MDA和H2O2含量最高，分别为13.61 nmol/g、131.06 μg/g，其次为壮龄树，分别为12.77 nmol/g、118.07 μg/g，幼树叶片中的MDA和H2O2含量最低，分别为7.83 nmol/g、110.04 μg/g。在二年生叶片中，古树叶片中的MDA含量最高，为22.88 nmol/g，壮龄树叶片中H2O2含量最高，为416.26 μg/g。
2.3 油茶叶片中渗透调节物质含量的变化
古树一年生叶片中3种渗透调节物质含量均高于二年生叶片中的含量（表3），分别为8.58 μg/g、23.83 mg/g、17.15 mg/g。壮龄树一年生叶片中脯氨酸和可溶性蛋白含量高于二年生叶片，可溶性糖含量显著低于二年生叶片。而幼树一年生叶片仅有可溶性蛋白含量显著高于二年生叶片，为27.24 mg/g。
随着油茶树树龄的增加，一年生叶片中的脯氨酸和可溶性糖含量逐渐增加，在古树叶片中的含量最高，分别是幼树叶片中含量的6.70、1.15倍，而可溶性蛋白含量在古树中远低于壮龄树和幼树，仅为17.15 mg/g。二年生叶片中的脯氨酸含量变化趋势不同于一年生，古树叶片中脯氨酸含量最高，为8.58 μg/g，而可溶性糖和可溶性蛋白的最大含量分别出现在幼树和壮龄树，分别为30.63、25.90 mg/g。
2.4 油茶叶片中SOD、POD和CAT活性的变化
在3种树龄油茶中，二年生叶片中SOD活性显著高于一年生叶片中酶活性，尤以古树叶片中SOD活性最高，为898.37 U/g;虽然二年生叶片POD活性在壮龄树和幼树中略高于一年生叶片，但3种树龄不同年龄叶片中POD活性之间差异不显著;除幼树叶片中CAT活性以外，其他树龄不同年龄叶片中CAT活性差异不显著（表4）。
3种树龄油茶的一年生油茶叶片中，古树叶片中SOD活性为372.52 U/g，显著低于壮龄树和幼树，而POD和CAT的活性显著高于壮龄树和幼树，分别为34.68、585.91 U/（g·min）。二年生叶片中，古树叶片中SOD、POD、CAT酶活性最高，分别为 898.37 U/g、25.31 U/（g·min）、487.64 μg/（g·min），其次是壮龄树叶片中的酶活性，幼树叶片中的酶活性最低（表4）。
3 结论与讨论
叶绿素是植物进行高效光合作用的保证，叶绿素的降解也是植物叶片衰老的主要标志[20]。在本试验中，随油茶树龄的增加，相同叶龄的油茶叶片中叶绿素含量在古树中明显高于壮龄树和幼树，这在一定程度上反映出油茶古树叶片内的生命活动更为活跃，且叶片中叶绿素a含量与叶绿素b含量的比值有所增加，这与戚元春等对古樟树（Cinnamomum camphora）的研究结果[21]相一致。在小麦的生长过程中，叶片中叶绿素a和叶绿素b含量的比值产生了变化，衰老叶片中叶绿素a含量与叶绿素b含量的比值增加[22]。但关于古树中叶绿素含量高于其他树龄的树种少有报道，油茶古树叶片中叶绿素含量高于幼树的生理机制，尚待进一步研究。
可溶性糖可维持生理代谢反应场所的渗透平衡动态[23]，可溶性蛋白作为各种新陈代谢反应的催化剂，也与叶绿素形成色素蛋白复合体，影响植物光合作用。李东林等比较了黄山松不同龄阶针叶衰老指标，发现随树龄增加，可溶性蛋白含量与叶绿素含量的变化趋势呈正相关关系[24]。本试验结果，二者之间呈负相关关系，可能是由于古树自身存在的自我修复能力，树势逐渐增强;油茶古树中可溶性糖和可溶性蛋白的含量低于壮龄树和幼树，而脯氨酸含量在古树中有所增加，这可能与可溶性糖和可溶性蛋白分解有关[25-26]，增加的脯氨酸与可溶性蛋白和可溶性糖一同维持叶片细胞渗透压，保持了内生物膜的完整性[27]，延缓植物衰老进程。
脯氨酸同时还是一种抗氧化剂，与SOD、POD、CAT等抗氧化酶协同作用，清除细胞器产生的H2O2、·OH等活性氧（ROS），缓解ROS对细胞的氧化损坏[28]。植物衰老中积累的ROS对生物体具有毒害效应，加速植物的衰老[29-30]。在本试验中，古树二年生叶片中SOD活性要明显强于壮龄树和幼树;而POD和CAT活性在古树不同年龄叶片中均高于壯龄树和幼树。由3种酶活性与MDA含量变化的响应来看，油茶古树的MDA含量并没因树龄的增加而远高于壮龄树和幼树，H2O2含量的增幅也低于壮龄树和幼树，同时表现出较高的SOD、POD、CAT活性，这与古树叶片内抗氧化酶的活性调节是密不可分的。MDA和H2O2积累越多表明植物受到活性氧的伤害越大[29-30]，油茶古树中MDA和H2O2的含量仍处在较低的水平，抗氧化酶有效地清除了植物衰老过程中自身代谢所产生的ROS，古树依然保持正常生理代谢活动。
众多研究表明，植物中SOD、POD、CAT等酶活性会随植物衰老而大幅度下降，表现在MDA和H2O2大量的积累，树势的衰老度与树龄增长相一致[9，21]。在油茶古树生理特征指标上并没有表现出衰老的势态，甚至优于壮龄树和幼树，这可能是由于其他因素，如树势强、树体自生修复能力、土肥水管理等因素共同影响油茶树的生长和衰老过程。本试验从叶片生理方面解释了油茶古树抗衰老的生理机制，为油茶古树的复壮措施奠定了基础，从而可以有效保护古树，延长油茶树的经济效益周期。
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