[摘要] 目的 观察牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS）对人牙周膜干细胞（HPDLSCs）增殖及炎性因子表达的影响。方法 培养和鉴定HPDLSCs。实验分为3组，A组采用含有10 μg·mL-1 LPS的α-MEM培养液培养HPDLSCs，B组采用含有
10 ng·mL-1 LPS刺激单核细胞的上清液培养HPDLSCs，C组采用α-MEM培养液培养HPDLSCs。MTT法检测HPDLSCs的增殖能力，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HPDLSCs白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA的表达。结果 HPDLSCs具有克隆形成能力和骨向及脂向分化能力。与C组相比，A组和B组均抑制HPDLSCs的增殖，且B组比A组的抑制作用更明显（P<0.05）；A组和B组IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表
达均增加，且B组比A组增加更明显（P<0.05）。结论 牙龈卟啉单胞菌可通过LPS直接或间接地一方面抑制HPDLSCs的增殖，另一方面增加炎性因子的表达，从而加重牙周炎症组织的损伤，延缓牙周组织的自我修复。
[关键词] 脂多糖； 人牙周膜干细胞； 炎性因子
[中图分类号] R 781.4 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.017
牙周优势菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是公认的炎症启动因子，不仅作用于牙周组织介导牙周炎的发生和牙周组织损伤，而且对牙周组织的细胞也具有直接的细胞毒效应[1]。LPS可与单核/巨噬
细胞、内皮细胞等多种细胞膜受体结合，启动胞内信号转导系统，引起多种细胞因子和炎性介质合成和释放，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6等，导致血管通透性增加，体液渗出，淋巴细胞移行到炎症部位[2]。LPS刺激时人牙周膜干细胞（human pe-riodontal ligament stem cell，HPDLSCs）可作为免疫辅助细胞，通过自分泌作用产生IL-6、TNF-α等细胞因子，参与局部免疫反应，在牙周炎发生、发展中发挥重要作用[3]。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是来源于牙周膜的成体干细胞，
具有自我复制能力，能产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞，能够维持牙周膜功能的稳定，发挥生理性细胞更新和修复组织损伤的作用[4-5]。本实验通过LPS直接和间接刺激来观察HPDLSCs的增殖能力及炎性因子的表达，从而进一步探讨牙周炎炎症加重加深的机制。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器
α-MEM培养基、胶原酶、0.25%胰蛋白酶（Gibco BRL公司，美国），胎牛血清（杭州四季青生物工程
材料有限公司），牙龈卟啉单胞菌LPS（Sigma公司，美国），细胞总RNA提取试剂盒、一步法逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reac-tion，RT-PCR）试剂盒（Takara公司，日本），倒置显微镜以及照相系统（Olympus公司，日本），酶联免疫
检测仪（BIO-TEK公司，美国），RT-PCR仪（Applied
Biosystems公司，美国）。
1.2 取材和细胞培养
收集12～18岁因正畸需要而拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙或者健康的第三磨牙，PBS反复冲洗，刮取根中1/3牙周膜组织，移入10 cm无菌培养皿内，滴加少许α-MEM培养液（含100 U·mL-1青霉素、
100 μg·mL-1链霉素）保持组织湿润，锐性分离约1 mm3的牙周膜组织块，胰酶消化15 min，离心弃上清，将分离的组织块均匀平铺于6孔板内，以无菌盖玻片覆盖组织块，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养液。置37 ℃、50 mL·L-1 CO2的孵箱中培养，每3天换液1次，待细胞生长达80%汇合时进行传代。
1.3 HPDLSCs的鉴定
1.3.1 克隆形成率 取对数生长期的第一代HPDLCs细胞，计数800个接种到直径10 cm的培养皿中常规培养，待细胞出现克隆（细胞克隆判断标准：大于等
于50个细胞为一个克隆族），弃原液，PBS冲洗3次，10%多聚甲醛固定10 min，再用PBS冲洗3次，甲苯氨蓝常温下染色30 min，体视显微镜下观察，计算克隆形成率N。计算公式为：N=克隆族形成数量/接种细胞数量×100%。
1.3.2 体外多向诱导分化 1）矿化诱导：采用筛选培养的HPDLSCs制成细胞悬液，调整细胞密度为每毫升2×104个接种于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培养24 h后换矿化诱导液（100 μg·mL-1链霉
素、100 U·mL-1青霉素、10 mmol·L-1 β-甘油磷酸钠、50 μg·mL-1维生素C、1×10-8 mol·L-1地塞米松、10 ml·L-1胎牛血清、α-MEM培养液）培养，隔日换
液。培养3周后吸弃培养液，PBS清洗，10%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2次，加入0.1%茜素红（Ali-zarin Red-S）室温染色30 min，去离子水清洗3次，
光镜下观察。对照组仅用α-MEM培养液，其他步骤不变。2）成脂诱导：用筛选培养的HPDLSCs制成细胞悬液，调整细胞密度为每毫升1×105个接种于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培养24 h以后换成脂诱导液（地塞米松1×10-6 mol·L-1、吲哚美辛25×
10-6 mol·L-1、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤125×10-6 mol·L-1、胰岛素10 mg·L-1、α-MEM培养液）培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液，PBS清洗，10%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗2次，油红O染色10 min，去离子水清洗3次。对照组仅用α-MEM培养液，其他步骤不变。倒置显微镜下观察。
1.4 MTT法检测HPDLSCs的增殖能力
实验分为3组，A组用含有10 μg·mL-1 LPS的α-MEM培养液培养HPDLSCs，B组采用含有10 ng·mL-1 LPS刺激单核细胞的上清液培养HPDLSCs，C组（对
照组）采用α-MEM培养液培养HPDLSCs。LPS刺激单核细胞上清液的制备方法：分离人外周血单核细胞，用含有10 ng·mL-1 LPS的α-MEM培养液37 ℃培养3 d，收集培养上清液，经0.22微孔滤膜过滤后置冻存管中-20 ℃保存备用，复温至37 ℃解冻可用。
每组取第3代HPDLSCs接种于每孔2×103个细胞的96孔培养板内。隔日换液，每日每组分别取5个复孔，MTT法测各孔光密度（optical density，OD）值，连测
7 d，以时间为横轴、细胞数为纵轴绘制生长曲线。
1.5 RT-PCR检测HPDLSCs的IL-1β、IL-6和TNF-α
mRNA的表达
实验分组方法同1.4。采用Trizol总RNA一步法提取细胞RNA。cDNA合成体系为20 μL，按照逆转录试剂盒说明书，采用随机引物法将RNA逆转录为cDNA，-20 ℃保存备用。参照GenBank数据库，采用Primer primer 5.0计算机软件设计引物，基因序列见表1。引物由Takara公司合成，反应条件参考产品说明书。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。循环35次，72 ℃检测信号。以β-actin为内参照。反应结束后在PCR仪上自动读取阈值Ct。每例样品及阴性对照均设5个平行复孔，取均值。
1.6 统计学分析
采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两独立样本均数比较用t检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 HPDLSCs的分离及培养
原代细胞培养3～7 d时，组织块周围有细胞爬出（图1左），2周左右可达80%汇合。细胞呈圆形、多角形等多种形态，但都表现为胞核聚集在中心，胞质形成的突起向外呈放射状，具有成体干细胞的特征（图1右）。
2.2 HPDLSCs的鉴定
2.2.1 HPDLSCs克隆形成率 培养7～10 d时，细胞克隆形成，镜下观察细胞呈集落状生长，形态成梭形，体积较小，排列紧密，中心细胞界限不清，呈圆形或不规则形状，周边细胞呈梭形或多角形（图
2）。HPDLSCs的克隆形成率为38%±1.21%。
2.2.2 成骨诱导 成骨诱导液连续培养7 d后，细胞呈复层生长，局部增厚；14 d左右，中央出现许多颗粒样改变，并逐渐连接成片；21 d左右，孔板底部出现肉眼可见针尖大小灰白色小结节，并逐渐增大。茜素红染色可见红色矿化结节（图3左），表明HPDLSCs
具有骨向分化能力。对照组的细胞成复层生长，未见矿化结节形成（图3右）。
2.2.3 成脂诱导 成脂诱导液连续培养7 d左右，可见细胞形态发生改变，至21 d时油红O染色阳性，细胞胞浆内有大量脂滴形成（图4左），表明HPDLSCs具
有脂向分化能力。对照组的细胞成复层生长，未见脂滴形成（图4右）。
2.3 HPDLSCs的增殖能力
与C组相比，A组和B组均抑制HPDLSCs的增殖，且B组比A组的抑制作用更明显，差异均具有统计学意义（P<0.05）（图5）。
图 5 3组HPDLSCs的增殖能力
Fig 5 Proliferation ability of HPDLSCs of three groups
2.4 RT-PCR检测
RT-PCR检测结果表明，与C组相比，A组和B组IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达均增加，且B组比A组增加更明显，差异均具有统计学意义（P<0.05）
（表2）。
3 讨论
牙周病是发生在牙齿周围支持组织的一种病因复杂的慢性、炎症破坏性疾病，是人类最普遍的疾病之一。革兰阴性厌氧菌是感染牙周组织的优势菌，其菌体的有效结构成分内毒素是一类具有高度生物学活性的物质，细胞壁LPS是内毒素的主要成分，是一种确定的导致牙周组织破坏的毒力因子，对成纤维细胞具有明显的细胞毒性作用，并可作用于免疫活性细胞和成纤维细胞，引起各种细胞因子的合成和释放，加重牙周组织炎性反应，在牙周炎的发生发展中起关键作用。张凤秋等[6]研究表明：牙龈卟啉
单胞菌、中间普氏菌、伴放线放线杆菌的内毒素为100 μg·mL-1时，可显著抑制人牙周膜细胞的增殖。牙龈卟啉单胞菌LPS为1 mg·L-1时，能增强牙周膜细胞（periodental ligament cells，PDLCs）的增殖，不会改变其组织学形态[7]。本实验选择10 μg·mL-1 LPS直接刺激HPDLSCs和10 ng·mL-1 LPS刺激单核细胞所得上清液刺激HPDLSCs，这两种培养液刺激的浓度均远低于引起细胞毒性的界限，不会造成细胞损伤。与对照组相比，10 μg·mL-1 LPS和10 ng·mL-1 LPS刺激单核细胞所得上清液的炎症微环境均抑制HPDLSCs的增殖，使细胞的增殖能力降低，说明LPS能通过直接或间接方式抑制HPDLSCs的增殖；然而LPS刺激单核细胞介导的炎症微环境比单独的LPS对HPDLSCs的抑制作用明显，说明LPS部分可能通过激活单核细胞后释放多种生物活性物质间接抑制HPDLSCs的增殖，另一部分可能通过直接作用抑制HPDLSCs的增殖，因此在两种方式叠加的作用下进一步抑制了HPDLSCs的增殖。
IL-6、TNF-α是淋巴细胞、单核细胞及成纤维细胞产生的一种多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性[8-9]。牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌的LPS
可诱导正常人牙龈成纤维细胞中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的合成及其mRNA的表达[10]。牙龈卟啉单胞
菌LPS首先与细胞表面受体结合，然后刺激细胞分泌炎性细胞因子，因而在牙周炎炎症过程中起重要作用[11]。研究[12-13]报道，牙龈卟啉单胞菌LPS可以促进肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和单核细胞分泌IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和前列腺素E2，可使HGF的IL-1和IL-6分泌水平明显增高。研究[14]显示，l～100 μg·mL-1 LPS均能刺激HPDLCs分泌TNF-α，在6～24 h内释放到上清液中的TNF-α的量随时间延长和LPS浓度升高而增高，24 h后呈下降趋势。本研究发现：牙龈卟啉单胞菌LPS一方面可通过直接刺激HPDLSCs产生IL-1、IL-6和TNF-α，另一方面可通过刺激单核细胞所得上清液的炎症微环境间接刺激HPDLSCs产生IL-1、IL-6和TNF-α，说明LPS不但能直接诱导HPDLSCs炎性因子的合成和分泌，而且还能通过刺激单核细胞上清液的炎症微环境间接诱导HPDLSCs炎性因子的合成和分泌。在LPS刺激单核细胞培养上清的炎症微环境中，除已知的IL-1、IL-6、TNF-α外，可能还有其他细胞因子或活性物质影响HPDLSCs炎性因子的表达，因此并非由于培养上清中某一种细胞因子的作用所致，可能是培养上清中所有生物活性物质以及上清中含有的LPS共同作用的结果。Quintero等[15]发现，LPS和TNF-α在刺激PDLCs旁分泌方面存在交互作用，LPS和TNF-α同时存在时，LPS能刺激PDLCs分泌一系列促炎因子，如IL-1、IL-6、PGE-2等。IL-1也可与LPS、TNF-α以及一些其他的炎性因子发生作用构成一个复杂的网络，调控IL-6的产生。LPS刺激单核细胞培养上清的炎症微环境导致HPDLSCs炎性因子的表达升高也有可能是炎性因子之间相互作用的结果。
IL-6、TNF-α启动子区存在核转录因子（nuclear factor，NF）-κB、IL-6核因子（nuclear factor of IL-6，NF-IL-6）、糖皮质激素反应元件（glucoeorticoid res-
ponsive elements，GRE）、活化蛋白转录因子（acti-
vator protein transcription factor，AP）-1、AP-2、活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cell，
NFAT）等多个转录因子结合位点[15-16]。LPS激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，
MAPK）和NF-κB等转录因子，转录因子激活后由胞浆进入胞核与启动子区的DNA结合位点结合，正向调控IL-6、TNF-α的mRNA表达，诱导其分泌。LPS通过磷酸化激活P38，引起P38从胞浆到胞核移位。激活的P38通过磷酸化转录因子增加TNF-α基因转录活性[17]。本研究推测脂多糖可能通过对牙周膜干
细胞的增殖及炎性因子分泌这两方面的影响，来加重牙周炎炎症，延缓组织自我修复。这为牙周炎的研究提供了一定的理论基础。本实验仅从脂多糖着手研究其对牙周膜干细胞生物学特性的影响，然而信号通路及机制的调控作用今后尚需作进一步深入的研究。
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（本文编辑 李彩）