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摘要[目的]采用高通量测序技术分析鞣花酸对大鼠肠道菌群组成和多样性的影响。[方法]采集持续灌胃鞣花酸SD大鼠的粪便，运用高通量测序技术对粪便肠道菌群进行分析，通过生物信息学方法分析大鼠肠道菌群的多样性和结构组成。[结果]通过高通量测序发现灌胃鞣花酸使SD大鼠肠道菌群的多样性增加（P<0.05），灌胃期间菌群的组成也发生了明显的波动，在门水平菌群变化中，拟杆菌门丰度增高（P<0.05），变形菌门丰度则降低到较低水平（P<0.01）;在属水平菌群变化中，Bacteroidales S24-7 group、Lachnospiraceae NK4A136 group和拟杆菌属所占比例显著升高（P<0.05、0.01）。[结论]鞣花酸对大鼠肠道菌群具有调节作用。
关键词鞣花酸;肠道菌群;高通量测序
中图分类号R 965文献标识码A
文章编号0517-6611（2019）18-0171-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.046
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Effects of Ellagic Acid on Gut Microbiota in SD Rats Evaluated by High-throughput Sequencing
SHEN Qi-bing， LI Shu-juan， LIU Tong-fang et al
（SPAC Enter Space Science and Technology Institute， Shenzhen，Guangdong 518117）
Abstract[Objective]To analyze the effect of ellagic acid on the intestinal microbiota of SD rats by using Miseq high-throughput sequencing technology. [Method]SD rats were continuously fed with ellagic acid， the fecal samples during feeding were collected and analyzed by Illumina MiSeq for 16s sequencing. Afterwards， Bioinformatics methods were applied for illuminating diversity and constitution in gut microbita. [Result]The gut microflora had an upward trend in diversity （P<0.05） and remarkable variation in constitution. At the level of the phylum， the abundance of Bacteroides increased to a higher level （P<0.05）， while that of Proteobacteria decreased gradually （P<0.01）. At the genus level， the proportions of Bacteroidales S24-7 group， Lachnospiraceae NK4A136 group and Bacteroides were significantly elevated （P<0.05 or P<0.01）. [Conclusion]Ellagic acid modulates the intestinal flora of SD rats.
Key wordsEllagic acid;Gut microbiota;High-throughput sequencing
鞣花酸，别名并没食子酸，广泛分布于石榴、板栗、草莓、黑莓、紅莓及胡桃等水果或坚果中。鞣花酸是富含羟基的天然多酚类化合物，其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及调节肠道菌群等多种生物活性，对预防或治疗慢性疾病如癌症、糖尿病和神经性病变等具有潜在的应用价值[1]。
动物肠道中栖息着数量巨大的微生物，统称为肠道菌群，其跟宿主的生理、代谢和免疫，甚至情绪和认知能力都有关联[2]，肠道菌群一旦失调就会对宿主的健康产生影响。鞣花酸的抗氧化、抗炎及抗肿瘤活性已经被国内外学者系统论证，而其对肠道菌群影响的相关研究鲜有报道。笔者采用高通量测序技术考察鞣花酸对大鼠肠道菌群的影响，从改善肠道微生态环境的角度初步揭示鞣花酸调节肠道菌群的作用机制，为富含鞣花酸类食品资源的科学利用提供参考依据。
1材料与方法
1.1材料
SPF级SD大鼠6只，雄性，平均体质量为 （200±10）g，购自广东省医学动物实验中心，许可证号为SCXK（粤）2013-002。鞣花酸提取物，纯度为90%，购自陕西慧科植物开发有限公司。
1.2方法
1.2.1样本的采集与处理。
SD大鼠喂养于独立通风笼具中，每个笼具1只，光照黑暗时间比为12 h∶12 h，期间自由进食饮水，适应性喂养7 d后开始试验。采用自身前后对照，试验开始前收集空白粪便样本（Day 0）于干燥无菌的离心管中，试验开始后给予400 mg/kg的鞣花酸提取物，共28 d，分别在第7天（Day 7）、第14天（Day 14）、第21天（Day 21）、第28天（Day 28）采集粪便样本，采集后迅速密封，于 -80 ℃冰箱中冷冻保存。
1.2.2肠道菌群16s高通量测序。
试验流程如图1所示，提取样品总DNA后，根据保守区设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化构建测序文库，用Illumina进行测序。高通量测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别（base calling）分析转化为原始测序序列（sequenced reads），结果以FASTQ（简称为fq）格式保存，其中包含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量值。
MiSeq测序得到的是双端序列数据，首先根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接（merge）成一条序列，同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤，得到优化序列，再对样品进行菌群多样性分析及群落结构分析。
2结果与分析
2.1菌群多样性分析
利用Usearch软件在97%相似水平下对每个样品的OTU（operational taxonomic units）进行生物信息统计分析，OTU数量可以代表样品物种的丰度[3]。由表1可知，在灌胃过程中OUT数量逐步增加，OTU数量最多的为Day 28组（639），最少的为Day 0组（564），灌胃鞣花酸后OUT数量增多（P<0.05）。同时，Alpha多样性分析也表明，给大鼠灌胃鞣花酸后，其肠道菌群的多样性高于灌胃前。Chao1、ACE、Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品多样性越高，5组样品中以Day 28组的Chao1、ACE、Shannon值最大（分别为709.53、704.30、4.695），且与Day 0组存在显著性或极显著性差异;Day 28组的Simpson值在5组样品中最小（0.022），与Day 0组也存在极显著性差异。Coverage指数是样品的测序深度，也表明样品的覆盖率，5组样品的Coverage 指数均在0.99以上，表明样品中序列未被检测到的可能性较低，测序质量较好。各组样品粪便菌群的OTU数量及Alpha多样性说明，灌胃前后大鼠粪便中菌群丰度和多样性存在显著性差异，且在灌胃过程中呈上升趋势，这表明鞣花酸对大鼠的肠道菌群具有一定的调整作用。
2.2菌群结构分析
SD大鼠肠道微生物在门（Phylum）水平物种分布如图2所示，从图中可以看出，主要有五大类：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和放线菌门（Actinobacteria）。其中，厚壁菌门和拟杆菌门的丰度最大，占比达90%以上[4]。
从各组样品的菌群结构上看，灌胃前后大鼠菌群结构差异具有显著性（表2）。拟杆菌门作为肠道内第二大优势类群，参与碳水化合物、脂类的代谢，对维护宿主健康起着非常重要的作用。灌胃鞣花酸后拟杆菌门比例从35.89%逐步增加至44.17%，其中，Day 7组、Day 14组与Day 0组相比无统计学差异，Day 21组、Day 28组与Day 0组相比存在显著性差异，说明从灌胃后第21天开始拟杆菌门比例显著增加（P<0.05），提示肠道中物质代谢存在一定程度的优化[5]。与之相反，变形菌门比例在灌胃鞣花酸后大幅度降低，与Day 0组相比，Day 7组、Day 14组、Day 21组和Day 28组均具有高度统计学意义（P<0.01），而变形菌门包括很多病原菌，如大肠杆菌和沙门氏菌等，这类细菌易引起动物腹泻[6]，说明鞣花酸对变形菌门具有一定的抑制作用。
如图3和表3所示，在属（Genus）水平上，灌胃鞣花酸后Bacteroidales S24-7 group、Lachnospiraceae NK4A136 group和拟杆菌属Bacteroides含量显著增加。Bacteroidales S24-7 group属于丁酸盐产生菌，灌胃过程中比例从Day 0组2797%增加至Day 28组32.52%（P<0.05），丁酸盐的有效成分是丁酸，丁酸属于短链脂肪酸（SCFAs）的一种，由肠道微生物发酵产生。丁酸盐不仅能参与机体的代谢，维持肠道微生态平衡，还能够改善肠道结构，参与免疫调控和肠屏障功能调节[7]，因此丁酸鹽产生菌在维持肠道健康方面发挥了非常重要的作用[8];灌胃后Day 21组和Day 28组的Lachnospiraceae NK4A136 group比例与灌胃前Day 0组相比分别存在显著性和极显著性差异（P<0.05，P<0.01），而Lachnospiraceae NK4A136 group具有发酵碳水化合物的特点，对宿主健康维护具有重要的促进作用;拟杆菌属作为肠道菌群的优势菌属，从Day 14组开始占比即显著性增加（P<0.05，P<0.01），其能够维持肠道的正常生理功能并参与宿主的营养吸收，与宿主互惠共生[9-10]，主要将宿主摄取的糖类分解成简单的糖，有利于其他菌属进行代谢利用[11]。变形杆菌属Proteus是条件致病菌，在特殊情况下对宿主致病，只在灌胃前粪便中检出，说明鞣花酸能够抑制变形杆菌属的生长。
3结论
该试验通过单变量分析，采用高通量测序分析方法对持续灌胃鞣花酸大鼠的肠道菌群进行检测，结果表明，鞣花酸不会影响肠道优势菌群的种类，但对肠道优势菌群的组成比例有影响。在门水平菌群变化中，鞣花酸可以有效增加拟杆菌门（Bacteroidetes）的含量，减少变形菌门（Proteobacteria）的含量。在属水平菌群变化中，鞣花酸可以有效增加Bacteroidales S24-7 group、Lachnospiraceae NK4A136 group和拟杆菌属Bacteroides的含量，减少变形杆菌属Proteus的含量。结合粪便菌群多样性分析结果可知，鞣花酸能够提高大鼠肠道菌群的多样性，在一定程度上促进有益菌的增加，并抑制致病菌的生长繁殖。综上所述，鞣花酸对肠道菌群具有调节作用，能够优化肠道的菌群结构。
參考文献
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