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摘要：【目的】明确桉树枝瘿姬小蜂（Leptocybe invasa Fisher & La Salle）体内可培养细菌多样性，为利用微生物防治该害虫打下基础。【方法】利用传统的细菌分离培养与鉴定方法，结合16S rDNA测序和系统发育分析，对刚羽化的桉树枝瘿姬小蜂雌成虫体内可培养细菌进行多样性分析。【结果】从桉树枝瘿姬小蜂体内分离出11株细菌，经鉴定归类于3个门（厚壁菌门、放线菌门和变形菌门）3个纲（芽孢杆菌纲、放线菌纲和γ-变形菌纲）4个目（芽孢杆菌目、微球菌目、乳酸杆菌目和肠杆菌目）8个科（芽孢杆菌科、微杆菌科、葡萄球菌科、乳酸杆菌科、纤维单胞菌科、微球菌科、肠杆菌科和类芽孢杆菌科）8个属（芽孢杆菌属、微杆菌属、葡萄球菌属、片球菌属、纤维单胞菌属、微球菌属、埃希氏杆菌属和类芽孢杆菌属），其中，厚壁菌门（Firmicutes）6株，为优势类群;芽孢杆菌属（Bacillus）3株，为优势菌属。【结论】桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌具有丰富的多样性。
关键词： 桉树枝瘿姬小蜂;雌成虫;可培养细菌;细菌多样性
中图分类号： S718.83 文獻标志码： A 文章编号：2095-1191（2018）12-2432-08
Isolation， identification and diversity of culturable bacteria in female adults of Leptocybe invasa Fisher & La Salle
WANG Rui-rui1， HU Ying1， YANG Zhen-de1，2*， GUO Chun-hui1， ZHU Lin-hui1，
ZHENG Xia-lin3， YU Shu-zhong1
（1College of Forestry， Guangxi University， Nanning 530004， China; 2Guangxi Key Laboratory of Forestry Ecology and Conservation， Nanning 530004， China; 3College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， China）
Abstract：【Objective】The diversity of culturable bacteria in Leptocybe invasa Fisher & La Salle was clarified to lay a foundation for microbiological control on the pest. 【Method】Traditional methods of bacterial isolation， culture and identification combined with 16S rDNA sequence and phylogenetic analysis were used for the study on the diversity of culturable bacteria in the female adults of L. invasa that were newly emerged. 【Result】Eleven strains of bacteria were isolated from the sexually matured female L. invasa， belonging to three phyla（Firmicutes， Actinobacteria and Proteobacteria）， three classes（Bacilli， Actinobacteria and Gammaproteobacteria）， four orders（Bacillales， Micrococcales，Lactobacillales and Enterobacterales）， eight families（Bacillacea， Microbacteriaceae， Staphylococcaceae， Lactobacillaceae， Cellulomonadaceae， Micrococcaceae， Enterobacteriaceae and Paenibacillaceae） and eight genera（Bacillus， Microbacterium，Staphylococcus， Pediococcus， Cellulomonas， Microbacterium， Escherichia and Paenibacillus）， among which Firmicutes（six strains） was the dominant bacterium and Bacillus（three strains） was the dominant genus. 【Conclusion】The diversity of culturable bacteria in L. invasa is rich.
Key words： Leptocybe invasa Fisher & La Salle; female adults; culturable bacteria; bacterial diversity
0 引言
【研究意义】桉树枝瘿姬小蜂（Leptocybe invasa Fisher & La Salle）隶属膜翅目（Hymenoptera）小蜂总科（Chalcidoidea）姬小蜂科（Eulophidae），是一种严重危害桉属（Eucalyptus）植物枝叶的外来入侵致瘿性害虫（Mendel et al.，2004）。该害虫原产于澳大利亚，2000年在中东地区及地中海沿岸国家首次暴发，因其繁殖速度快、世代重叠、暴发期长，现已扩散至亚洲、非洲、欧洲及北美洲等地区的26个国家，给桉树生产造成巨大损失，是目前国际上高度重视的桉树危险性害虫（Zheng et al.，2014）。鉴于昆虫体内细菌对其宿主生长发育、营养代谢、生殖、行为、免疫、抗逆及抗药等发挥的重要作用，同时在害虫防治、昆虫资源开发及生物能源生产等领域展现出巨大的应用潜力（Hosokawa et al.，2016;王四宝和曲爽，2017;张振宇等，2017），因此，研究桉树枝瘿姬小蜂体内可培养细菌的组成和多样性有助于进一步探明其体内可培养细菌的功能，为利用微生物防治法控制该害虫提供理论基础。【前人研究进展】近年来，随着微生态学理论及实践范围的不断扩大，有关昆虫肠道微生物的研究日益增多。夏晓峰等（2013）利用传统的微生物培养方法从小菜蛾（Plutella xylostella）3龄幼虫中肠分离得到8株细菌，分属于沙雷氏菌属（Serratia）、肠杆属（Enterobacter）、寡养单胞菌属（Stenotrophomononas）和香味菌属（Myroides）4个属。Nugnes等（2015）利用Wolbachia、Cardinium、Rickettsia、Spiroplasma和Arsenophonus特异性引物分别对雌、雄桉树枝瘿姬小蜂体内微生物总DNA进行PCR扩增，变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析发现只有Rickettsia存在于其体内，并影响桉树枝瘿姬小蜂的生殖能力。刘小改等（2016）对稻纵卷叶螟[Cnaphalocrocis medinalis（Guenée）]4龄幼虫肠道细菌的16S rDNA V3-V4变异区进行测序分析，发现其肠道细菌多样性较丰富，不同样本数量间微生物群落结构和多样性存在明显差异，其中类诺卡氏属（Nocardioides）和鞘脂单胞菌（Sphingomonas）为4个样本的共有优势属。李文丹等（2018）采用16S rDNA文库随机测序法对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua（Hübner）]初孵和1日龄幼虫整个虫体、3龄和5龄幼虫中肠细菌进行调查分析，发现甜菜夜蛾中肠存在多种共生细菌，其中不动杆菌属（Acinetobacter）为优势共生菌，且不同的发育时期其共生菌种类与相对丰度存在明显差异。【本研究切入点】目前对桉树枝瘿姬小蜂体内微生物的研究仅采用DGGE分析方法检测其体内是否具有与生殖相关的菌株，而对桉树枝瘿姬小蜂体内细菌群落组成、多样性及各菌株生态功能的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】桉树枝瘿姬小蜂多为雌性，大多数雌蜂在破瘿出蜂前已携带成熟蜂卵，是一种孤雌生殖昆虫，雄蜂难以捕获。本研究利用传统微生物分离鉴定与16S rDNA序列分析相结合的方法，对桉树枝瘿姬小蜂冬季雌成虫体内可培养细菌进行分离和鉴定，以了解其体内可培养细菌的优势种群及多样性，为更好地开发基于共生关系调控或对内共生菌进行基因改造的“抑菌防虫”生物防治新技术打下基础。